第一章基因工程第一节基因工程的概述【学习目标】1、简述基因工程的概念含义，简述基因工程的诞生历程，认同基因工程的诞生和发展离不开理论突破和技术创新2、简述基因工程的原理，说出DNA重组技术的基本工具及其作用、特点，简述基因工程基本操作程序，以及各步骤的一般方法、原理，模拟重组DNA分子的操作过程【课前预习】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，在通过人工和等方法，对生物的基因进行和，然后导入并使重组基因在中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
因而又叫DNA重组技术。
基因工程是在水平上操作、改变生物遗传性状的技术，包括基因的、以及在受体细胞内的和过程。
2、为基因工程的创立作出了重要的理论铺垫，而的发现，则直接促进了基因工程的诞生。
1973年，美国科学家将不同来源的两种DNA分子体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的表达。
3、“分子手术刀”：。
其作用的特点是：其产生的DNA末端有两种形式：和。
“分子针线”将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的。
4、“运载工具”。
通常利用质粒作为载体。
作为载体必须具备以下条件：载体DNA必需有一个或多个的切割位点；载体DNA必需能在受体细胞中；载体DNA必需带有特殊的基因。
5、基因工程的基本操作步骤包括：①②、③、④6、PCR是一项在生物复制特定DNA片段的核酸合成技术。
目的基因受热形成，与结合，在的作用下延伸形成DNA。
【共同探究】【思考题1】（10全国2）下列叙述符合基因工程概念的是A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上（一）DNA重组技术的基本工具1、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
它在切割DNA时，特异性识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割，这种能被特意性识别的切割部位都具有回文序列。
这种酶主要在原核生物中存在，有何意义？这给我们在基因工程中有什么启发？【思考题2】下列关于限制酶的说法正确的是A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C、不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键【思考题3】（10浙江卷）在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是A.用限制性核酸内切酶切割烟草茶叶病毒的核酸B.用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C.将重组DNA分子导入原生质体D. 用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞【思考题4】（07广东）现有一长度为1000碱基对（by）的DNA分子，用限制性核酸内切酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000 by，用Kpn1单独酶切得到400 by和600 by两种长度的DNA分子，用EcoRI,Kpnl同时酶切后得到200 by和600 by两种长度的DNA分子。
该DNA分子的酶切图谱正确的是D2、“分子针线”——DNA连接酶DNA连接酶是将双链DNA片段”缝合”起来,恢复被限制性核酸内切酶切开了两个核苷酸之间的磷酸二酯键.DNA连接酶与DNA聚合酶的相同点是：两者都是形成磷酸二酯键；成分都属于蛋白质。
不同点：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将两个缺口同时连接起来，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键【思考题5】下图为DNA分子的切割和连接过程。
（1）EcoRI是一种酶，其识别序列是，切割位点是与之间的键。
切割结果产生的DNA片段末端形式为。
（2）不同来源DNA片段结合，在这里需要的酶应是连接酶，此酶的作用是在与之间形成键，而起“缝合”作用的。
3、“运载工具”——目的基因进入受体细胞的载体目的基因的载体是基因的运输工具，在基因操作过程中，使用目的基因的载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
因此作为目的基因的载体必须具备三个条件：一是能在宿主细胞内稳定保存并大量复制，二是具有多个限制性内切酶的切点，以便与外源基因连接，三是具有某些标记基因，以便进行筛选。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
【思考题6】作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件及理由是A、能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选（二）基因工程的基本操作程序1、获得目的基因DNA复制和PCR技术DNA复制主要在细胞内完成，以DNA的两条链为模板，根据碱基互补配对原则合成两个完全相同的DNA分子的过程。
复制的条件是：以DNA双链为模板，以四中脱氧核苷酸为原料，需要线立体供应能量，还需要多种酶，如解旋酶、DNA聚合酶等。
PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
它遵循的原理与DNA复制原理相同，条件是有一段以知目的基因的核苷酸序列和根据核苷酸序列合成的引物，原料是四种脱氧核苷酸，也需要多种酶，如（耐高温的）DNA聚合酶，此酶和普通DNA聚合酶相比，要耐高温。
结果使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。
【思考题7】下列获取目的基因的方法中需要模板链的是①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③【思考题8】下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可以利用解旋酶来实现B．复制过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、能量、四种核糖核苷酸D．PCR技术与细胞内DNA复制相比所需要的酶最适温度较高2、制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）——基因工程的核心目的基因和质粒相结合形成重组质粒的过程是：（1）：用一种的限制性内切酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口；（2）：用同一种限制性内切酶切断目的基因，产生相同的黏性末端；（3）：将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处，在加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。
不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别（如启动子不同等）。
重组DNA（基因表达载体）组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点【思考题9】制备重组DNA分子的目的是什么？使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
【思考题10】（09上海理综卷）科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。
图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是A．基因自由组合定律B．半保留复制原则C．基因分离定律D．碱基互补配对原则【思考题11】科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。
起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。
然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导人棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。
科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。
由以上过程推知，作为目的基因的运载体应具备的结构是A．目的基因、启动子 B．目的基因、终止子C．目的基因、启动子、终止子 D．目的基因、启动子、终止子、标记基因【思考题12】（09浙江卷）下列关于基因工程的叙述，错误．．的是A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达3、转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）转化的方法：农杆菌介导转化技术、基因枪介导转化技术、花粉管通道技术、显微注射技术【思考题13】采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是( )①将毒素蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养④将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A、①②B、②③C、③④D、①④4、筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）检测质粒或重组质粒是否导入受体细胞，需利用质粒上某些标记基因（抗性基因）的特性，即对已经导入质粒或重组质粒、本身无相应特性的受体细胞进行检测，根据受体细胞是否具有相应的特性来确定重组质粒是否进入受体细胞。
例如质粒上有抗四环素和抗氨苄青霉素这两个特性基因，用含四环素或氨苄青霉素的选择培养基，受体细胞凡能生长则表明质粒导入成功。
基因成功表达的标志是受体细胞通过转录、翻译过程合成出目的基因的相应的蛋白质，可通过抗原---抗体反应进行检测。
也可通过个体生物学水平的鉴定：如抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【思考题14】用某人的胰岛素基因制成的DNA探针，检测下列物质，能形成杂交分子的是①该人胰岛A细胞中的DNA ②该人胰岛B细胞的mRNA③该人胰岛A细胞的mRNA ④该人肝细胞的DNAA．①②③④ B．①②③ C．①②④ D．②【课堂巩固】1．生命活动中起催化作用的酶都具有一定的专一性，下列四种酶作用的部位分别是①限制性内切酶②解旋酶③肠肽酶④ATP水解酶A．氢键、磷酸二酯键、氨基、高能磷酸键B．磷酸二酯键、碱基、肽键、高能磷酸键C．磷酸二酯键、氢键、氨基、磷酸键D．磷酸二酯键、氢键、肽键、高能磷酸键2．下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。
已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。
判断下列说法正确的是Bam H Ⅰ ↓ Eco R Ⅰ ↓ Hind Ⅲ ↓ Bgl Ⅱ↓ ↑ GGA TCC GAATTC AAGCTT AGA TCT CCTAGG CTTAAG TTCGAA TCTAGA ↑ ↑ ↑A ．将重组质粒导入细菌B 常用的方法是显微注射法或基因枪法B ．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C ．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌D ．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长3．限制酶是一种核酸内切酶，可识别并切割DNA 分子上特定的核苷酸序列。