卫生细菌学检验
第五章
大肠菌群的测定
第一节 大肠菌群测定的卫生学意义
一、定义及范围 大肠菌群（coliform group或coliform bacteria）: 在37 度能发酵乳糖，在24小时内产酸产气的需氧或兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。


包括大肠埃希菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属 的一部分及沙门菌属的Ⅲ亚属（发酵乳糖）组成。 通常大肠埃希菌对靛基质、甲基红、V-P、枸椽酸盐利用四个 生化反应分别为“++--”，称为典型大肠杆菌，其它类的称 为非典型大肠杆菌。
第四节 耐热大肠菌群的测定
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耐热大肠菌群的定义 大肠菌群的细菌在自然环境中存在时，逐渐适应25℃ ，在 37℃培养仍可生长，但将温度升至44.5℃时，则不再生长。 而直接来自人、畜粪便中的大肠菌群，不仅在37℃正常生长， 在 4 4 . 5 ℃ 也 可 继 续 生 长 ， 称 为 粪 大 肠 菌 群 （ faecal coliform）； 最 近 Ｗ Ｈ Ｏ 主 张 采 用 “ 耐 热 大 肠 菌 群 ” （thermotolerant coliform bacteria）。 定义：在44-45℃能发酵乳糖的革兰氏阴性无芽孢杆菌，包括 大肠埃希菌属、肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。
水源水 严重污染水：1，0.1,0.01,0.001mL 中度污染水：10，1，0.1,0.01mL 轻度污染水：100，10，1，0.1mL 大肠菌群变异不大的水源水：10mL10份 接种量1mL及1mL以内用单料乳糖胆盐发 酵管，接种量在1mL以上者，应保证接种后 发酵管中的总液体为单料培养液。
大肠菌群检索表（饮用水）
阳性管数 0 1 2 3 4 每升水样中大肠菌群数 0 ‹3 3 7 11 14 1 4 8 13 18 24 2 11 18 27 38 52 接种水样总量 300mL
(100mL 2 份， 10mL 10份)
备注
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6 7 8
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22 27 31
30
36 43 51
70
92 120 161
2. 检测的意义



耐热大肠菌群在卫生学上具有更大的意义，它在人 粪中占大肠菌群数的96.4%。 耐热大肠菌群在自然界中不生长，除非在具有丰富 营养、温度在13℃以上，无余氯的水中生长，也可 在工业污水、腐烂植物及土壤中发现。 如果大肠菌群和耐热大肠菌群均高，多为近期污染； 如果大肠菌群数高，而耐热大肠菌群低，则多为远 期污染。
检样
稀释
乳糖胆盐发酵管
胆盐、或去氧胆酸钠
产气 不产气 阴性 报告 革兰氏染色 革兰氏阴性无芽孢 乳糖发酵管 产气 不产气 阴性 EMB、远腾氏等
革兰氏阳性 阴性
报告
阳性
报告
报告Βιβλιοθήκη 2.多管发酵法测定方法发酵试验：在2个装有50mL的3倍浓缩（三料）乳糖胆盐蛋白 胨培养液（含溴钾酚紫指示剂）的大试管或烧瓶中，无菌 操作加水样100mL.在10支装有5mL的三料乳糖胆盐发酵管 中（内有倒臵小管），以无菌操作各加水样10mL,摇匀后， 37度培养24小时。 平板分离：将产酸产气及只产酸的发酵管，接种于伊红美蓝 （紫黑色有金属光泽）或远滕氏（淡粉红色）、麦康凯 （玫瑰红色）琼脂平板上，35-37度培养24小时。 证实试验：将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌菌落接种于单料乳 糖发酵管中， 35-37度培养24小时，产酸产气，即证实有 大肠菌群存在。
5.纸片快速法



制备培养基：营养成分溶解并调完酸碱度后，加入 指示剂溴甲酚紫，灭菌后加入TTC溶液。将新中华定 性滤纸切成规定大小，灭菌后备用。将制好的培养 基浸渍纸片，40℃烘干，备用。 接种：取各稀释度涂布于纸片上，37℃15h后观察结 果。 结果判定：纸片上出现紫红色菌落，周围有黄圈者 为阳性。
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3.注意事项




乳糖发酵试验—分离培养—证实试验三步中，初发酵与证 实试验可能相差较大。 抑菌剂如胆盐等对大肠菌群中的某些菌株会有抑制作用。 猪、牛、羊的胆盐效果较好，去氧胆酸钠对结果影响较大， 胆盐剂量以0.5%较适宜。 挑选菌落时，EMB平板上，紫色菌落检出率较高，红色、粉 色较低；无典型菌落时，宜多挑选。 有些在初发酵时产酸无气的，复发酵时却为阳性，用手轻 拍管壁，观察有无气泡上浮。
滤膜技术的优缺点

优点：重复性好，经常可能只需单一步骤，可在不同培养 基之间进行转移，可处理大量水样，增加了分析的灵敏度， 节省时间，较MPN法成本低。

缺点：高混浊度的水限制了取样的体积，背景细菌量较多， 导致过度生长，金属和酚能够吸附到滤膜上，抑制了微生 物生长。
2. Coli ID检测法

含有两种显色物质，可以直接识别大肠菌（coliforms）群和鉴 定大肠杆菌（Escherichia coli）,而不需附加任何试剂。抑制了 革兰氏阳性菌和酵母菌，菌落颜色变化的敏感性完全适合食品 微生物检验。红色菌落为大肠杆菌。蓝色菌落为其它大肠菌群。
3.TTC（氯化三苯四氮唑）显色快速法
（1）TTC乳糖培养基制备 2%乳糖发酵管：乳糖、蛋白胨、水 TTC培养液：蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、十二烷基磺酸钠、水 以无菌操作进行分装。 （2）三料TTC乳糖培养基 接种：接种1、0.1、0.01mL各三管于中，若接种量为10mL，则 用三料TTC乳糖培养基。 培养：35-37℃18-24h。 结果判定：观察有无红色及产气。
第三节 快速检测方法
1. 薄膜集菌法
薄膜集菌：取供试液333mL，以无菌薄膜过 滤，将细菌截留在薄膜上。 培养检查：将上述集菌的薄膜面向上平贴在 品红亚硫酸钠琼脂平板上，35-37℃培养24h， 如有红色发酵乳糖的革兰氏阴性无芽孢杆菌 的菌落，再做乳糖发酵试验。 发酵试验：接种于乳糖蛋白胨半固体培养基 上，37℃ 6h-8h，产气者为阳性。


饮用水在含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引 起肠道传染病的流行； 在一定条件下能在水中繁殖； 在外界环境中，有的沙门菌比大肠菌群更有耐受力。
3. 意义

控制肠道传染病的发生和流行 反映检样受粪便污染的程度 反映在生产各环节的卫生状况 具有广泛的卫生学意义
第二节 测定方法
1、测定程序
国际上如瑞士、瑞典等国以大肠菌群作为药品、食品、 饮水等的卫生指示菌。 以100mL水检样内允许含有的大肠菌群的实际数值，以 最大机率数（most probable number,MPN）来表示。
其它粪便污染指示菌
分支杆菌、拟杆菌、乳酸菌、梭状芽孢杆菌、粪链球菌
克雷伯菌、变形杆菌、副大肠杆菌
2. 不足之处
3.耐热大肠菌群的检查方法


乳糖发酵试验：药品检样10mL接种于双料胆盐 乳糖发酵管，44.5℃培养24h，发酵产气者， 进行确证实验。不产气者，报告为阴性。 确证试验：取产气的乳糖胆盐发酵管培养物划 线于EMB等琼脂平板上，臵于44.5℃培养1824h，凡平板上有典型菌落生长，则证实为耐 热大肠菌群阳性。
二、测定的意义


1892年，沙尔丁格提出将大肠菌群作为水质粪便污染 的指示菌（indicative bacteria） 成人粪便中大肠杆菌有108-109个/g。
1.大肠菌群作为指示菌的特性

适用于各种类型水的分析； 是存在于肠道中的特有菌； 当肠道病原体存在的同时大肠菌群也存在； 大肠菌群比最难对付的肠道病原体存活时间更长， 对外环境的抵抗力大于等于致病菌； 进入水中不再繁殖； 检验方法具有很强的特异性和高度敏感性 检验方法简便，易于操作、检出和计数 对人类无害 指示菌的水平与被粪便污染程度有某些直接的联系
（3）注意事项

产气观察要全面，小管是否堵塞，可轻拍 有颜色的检样稀释10倍后再接种 蛋白胨的质量要好 十二烷基磺酸钠可用洗衣粉替代
4 DC（去氧胆酸钠）半固体试管快速法



制备DC培养基（绿色）：将配方中各固体成 分加热溶于水后，调pH7.2，加入指示剂和 DC溶液，煮沸3min备用。 接种：先加样品，后注入培养基，充分混匀 后，凝固后，37℃18-24h。 结果判定：桔红色，有气泡产生或琼脂裂， 为阳性，绿色则为阴性。