§2 显微镜和显微技术
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借助于显微镜观察微生物的方法即显微技术， 显微技术是微生物检验技术中最常用的技术 之一。
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显微镜的种类和原理
显微观察样品的制备
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一、显微镜的种类和原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜
(一)、光学显微镜 相差显微镜
荧光显微镜
现在的光学显微镜分辨的最小极限达0.2μm。
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普通光学显微镜的几个基本概念
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1、普通光学显微镜
由三部分构成 ①照明系统：包括光源和聚光器； ②光学放大系统：由物镜和目镜 组成，是显微镜的主体，目镜和 物镜都由复杂的透镜组构成； ③机械装置：用于固定材料和观 察方便
样品承载
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载玻片
调节电磁透镜的流向
调节电磁透镜的流
向金属网（通常为铜
网）
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二、显微观察样品 的制备
（一）光学显微 镜制样
活体观察 染色
压滴法 悬滴法 菌丝埋片法
死菌
活菌
简单染色
鉴别染色
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革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色
美蓝染色
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光学显微镜样品制备－－活体观察
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（二）、电子显微镜的制样
样品在进行电镜观察前必须进行固定和干 燥，制样时一般采用重金属盐染色或喷镀， 提高在电镜下的反差。
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※1、透射电镜的样品制备
负染技术 投影技术 超薄切片技术 冰冻蚀刻技术
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负染 法
将样品的背景染色以凸现样品，所以称为负染法。
用高速电子束代替光束。放大倍数可达80万倍， 分辨的最小极限达0.2纳米。
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1、透射电子显微镜
目前TEM的分辨力可达 0.2nm。
用电子束作光源，用电磁场
作透镜。用于电镜的标本须制 成厚度约50nm左右的超薄切 片。放大倍数最高可达近百万 倍.由电子照明系统、电磁透镜 成像系统、真空系统、记录系 统、电源系统等5部分构成。
主要用于：样品表面结构
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扫描 电子 显微 镜原 理
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3、扫描隧道显微镜（STM）
扫11.1描2.2020隧道显微镜拍摄的7个铀原子团
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4 原子力显微镜
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油镜使用

光镜使用方法
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2、暗视野显微镜
原理：聚光镜中央有挡光片， 使照明光线不直接进人物镜， 只允许被标本反射和衍射的 光线进入物镜，因而视野的 背景是黑的，物体的边缘是 亮的。 适用范围：生活细菌运动性 观察。
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特点:只能看到物体的存在 与运动,不能辨清其微细结 构。
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高尔基体的 TEM照片(伪 彩色)
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2、扫描电子显微镜
大肠杆菌扫描电镜图
扫描电子显微镜
工作原理：电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多 少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和 放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。
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光学显微镜和电子显微镜的特点比较
特点
光学显微镜
电子显微镜
最高放大倍数 约1000-1500 10万以上
最佳分辨率 0.2微米
0.5纳米
辐射源
可见光
电子束
辐射源通过的媒介 空气
高真空
透镜类型
玻璃
电磁体
反差来源
光吸收的差异或特定波长 电子散射
聚焦机械
机械调节透镜位
改变放大倍数的方法 置 调换物镜或目镜
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光学显微样品制备－－染色观察
用途：微生物的细致形态和结构 染色前需要对样品固定. 常用固定方法：酒精火焰加热、化学固定
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1)、简单染色法：涂片→干燥→固定→染 色→水洗→干燥→镜检
2）、革兰氏染色法：涂片→固定→结晶紫 色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱 色→番红复染→水洗→干燥→观察
特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、 摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察
（1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖 玻片，观察。
（2）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液， 翻转置于特制的凹载玻片上，观察。
（3）菌丝埋片法：无菌小块玻璃纸铺于平 板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，培养， 取下玻璃纸置于载玻片上，观察菌丝形态。
暗视野显微镜的使用
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3、相差显微镜
基本原理:把透过标本的可见光的光程 差变成振幅差，从而提高了各种结构间 的对比度，使各种结构变得清晰可见。
相差显微镜使用
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适用范围：对透明的活体进行直接观察
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微分干涉差显微镜DIC显 微镜下的硅藻形态
一般是采用电子密度高，本 身不会显示任何结构，又和 样品不起反应的物质，如磷 钨酸的钠盐将样品包围，同 时染色剂还会进入观察对象 的内部，这样，既能显示外 形，又可在一定程度上反映 样品的内部结构。
负染法原理
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用途：可以观察细菌细胞、病毒等。
负染色法观察的鞭毛
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4、荧光显微镜
原理：荧光素吸收紫 外线并放出部分波长 较长的可见光，发荧 光的物体会在黑暗背 景显现为光亮有色物 体
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绿色：铜绿假单胞菌 黄色：蜡样芽孢杆菌
绿色：微管 红色：微丝 蓝色：核
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透射电子显微镜
（二）电子显微镜
扫描电子显微镜
1931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装 配完成的。
这是最常用的方法，可以观 察细胞或其它样品内部的细 微结构。 样品固定→脱水→包埋→切 片。 只有在20—100纳米厚度的 切片用透射电子显微镜才能 观察，所以一般细菌样品， 一个细胞要分割成10片到 50片。
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投影 法
在真空条件下，用电子散射能 力强的重金属原子来喷镀样品 表面，这样在样品和没有喷镀 的区域形成了较强的反差，而 没有喷镀的部分成了样品的投 影，根据投影了解样品的立体 形状、高度。
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用途：观察细菌的 鞭毛或病毒的颗粒
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投影法观察的噬菌体 40
超薄切片法