Preparation and Antioxidant Activity in vitro of Silkworm Pupa Polypeptide
MIN Jian-hua，LI Jian-ke*，CHEN Ting (College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, China)
子量为 10000D 的超滤膜进行分离，收集滤过液冷冻干 燥；超滤分离条件为操作压力 0.1MPa，温度为常温。 1.4 蚕蛹蛋白多肽体外抗氧化活性的研究
1.4.1 还原能力的测定 采用普鲁士兰法，参照文献[5 ]的方法测定。反应
液在 700nm 处的吸光度越高，还原力越强，抗氧化性 越好。 1.4.2 清除超氧阴离子自由基(O－2·)能力测定
respectively. Alcalase was confirmed as an optimal enzyme preparation to prepare silkworm pupa polypeptide in terms of degree of hydrolysis (DH) of material and DPPH· scavenging activity of hydrolysates. The enzymatic hydrolysis procedure
采用核黄素 - 光 - 氮蓝四唑体系测定，参照文献[6] 的方法。
O－2·清除率(%)=
A0－A ————×
100
A0
式中：A0 为空白对照液 5 6 0n m 时的吸光度；A 为 样品液 560nm 时吸光度。
1.4.3 清除羟自由基(·OH )能力测定 采用邻二氮菲 -Fe2+ 氧化法，参照文献[7]测定。
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食品科学
※工艺技术
碱性蛋白酶(alcalase)、风味蛋白酶(flavourzyme)、 复合蛋白酶(protamex) 丹麦 Novo 酶制剂公司；木瓜蛋 白酶、胰蛋白酶 Amresco 生化试剂公司；牛血清白 蛋白 北京舟鼎国生物技术有限责任公司；DPPH· 美 国 Sigma 公司；其他试剂均为国产分析纯。 1.2 仪器与设备
※工艺技术
食品科学
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蚕蛹多肽的制备工艺及其体外抗氧化活性
闵建华，李建科 *，陈 婷
(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安
710062)
摘 要：采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解蚕蛹蛋白，以水解度和清除
D P P H ·能力为指标对酶解过程进行分析，并研究水解产物多肽的体外抗氧化活性。结果表明，碱性蛋白酶对蚕 蛹蛋白具有较好的水解效果，其水解产物有较高抗氧化活性，对 DP PH ·、超氧阴离子自由基(O－2·) 和羟自由基 (·O H ) 都具有较强的清除能力。 关键词：蚕蛹蛋白；水解；抗氧化性
※工艺技术
食品科学
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某些肽键或带有某种基团的氨水解度，酶解产物的
活性也会不一样，在筛选制备蚕蛹抗氧化肽的最适酶种
时，不仅需要考虑水解度的大小，还应该考虑酶解物
的抗氧化能力大小。DPPH·是一种较为稳定的以氮为 中心的自由基，化学性质稳定，不易被清除，若受试
参考 Negi[8]和 Kaur[5]的方法，在此基础上进行改 进。在比色皿中加入1.95ml 质量浓度为 24mg/L的 DPPH· 乙醇(体积分数 95%)溶液，测定其在波长 515nm 处的吸 光度，然后加入 50μl 样品，记录加入提取物溶液后第 2、3、4、5min 的吸光度，5min 后每 5min 记录吸光 度 1 次，直到吸光度的改变在每分钟内不超过 0.003 单 位为止。
Abstract：As a high quality protein resource that contains 18 amino acids including 8 essential ones accounting for 40% of total
amino acids, silkworm pupa protein is more nutritional than soybean protein isolate. However, silkworm pupa protein is
parameters were as follows: substrate concentration 4%, enzyme/substrate concentration ratio 2:100, temperature 60 ℃, pH 4,
and hydrolysis duration 4 h, and under such conditions a DH of 28.2% was achieved. The hydrolysis product could effectively scavenge DPPH·, O－2· and OH· radicals, suggesting its strong antioxidant activity.
1.3.1 蚕蛹蛋白酶解工艺 取一定量蚕蛹蛋白粉，按 4%(m/V)底物浓度加入双
蒸水，在夹层玻璃反应器中搅拌，待温度恒定后，调 节一定的 pH 值，按酶与底物比(E/S)为 2:100(m/m，每 100g 蛋白质中所加的酶为 2g)加入蛋白酶开始水解，搅 拌状态下不断加入 0.5mol/L NaOH，以使反应体系的 pH 值始终维持在实验规定值范围内，用 pH-stat 法测定水 解度，水解一定时间后，终止反应，沸水浴灭酶 15min。冷却后以 4000r/min 离心 20min，收集上清液 4 ℃贮藏备用。
物能够清除它，则表示受试物具有较强的自由基清除能
力[10]。因此，DPPH·清除模型是一种广泛用于评价抗 氧化剂自由基清除能力的快速方法。
由图 1 可知，在前 30min 内，各酶水解度增速较
快，其后逐渐趋于平缓，表现出各自不同的特性。随
着酶解的进行，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的水解度增大趋
势明显，一直高于木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋
was optimized using orthogonal array method and the corresponding product was subjected to further analysis of antioxidant activity such as reducing power and O2－·, ·OH and DPPH·scavenging activities. The optimal Alcalase-catalyzed hydrolysis
１ 材料与方法
1.1 材料与试剂 蚕蛹 陕西安康百瑞丝绸有限公司；蚕蛹蛋白粉
自制。
收稿日期：2008-10-17 作者简介：闵建华(1982 －)，男，硕士研究生，研究方向为食品营养与卫生。E-mail：bobo123876@ * 通讯作者：李建科(1960 －)，男，教授，博士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：jiankel@
A－A0 ·OH 清除率(%)=(1 －————)× 100
A1－A2
式中：A 为加样品而不加 H 2O 2 的反应管吸光度； A0 为加入样品及 H2O2 的反应管吸光度；A1 为不加样品 也不加 H2O2 的反应管吸光度；A2 为加 H2O2 而不加样品 的反应管吸光度。
1.4.4 清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)活性测定 方法
白酶的水解度；1h 后，除碱性蛋白酶外，其他四种蛋 白酶水解进程曲线变得很平缓，其水解度明显低于碱性
A0－At DPPH·清除率(%)= —————× 100
A0
式中：A 0 为 D PP H ·乙醇溶液与对应溶剂的吸光 度；A t 为加入样品后 D P P H ·乙醇溶液时的吸光度。
２ 结果与分析
2.1 水解蚕蛹蛋白最适用酶的选择 具有生理活性的多肽主要是一些分子量较小的肽
段，而蚕蛹蛋白的水解度大小直接决定了多肽的分子量 大小，所以活性较强的肽段可能是那些水解度较大的酶 的酶解产物。而酶的专一性决定了某种蛋白酶可能只对
Key words：silkworm pupa protein； hydrolysis；antioxidant activity
中图分类号：TQ936.16
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2009)14-0123-04
生物活性肽是由蛋白质水解产生的含有数个到数十 个氨基酸组成的具有特殊生理功能的多肽类物质，其不 仅能够提供人体生长发育所需的营养物质，且具有重要 的生理功能，如神经、激素和免疫调节、抗血栓、抗 高血压、抗胆固醇、抗细菌、抗病毒、抗癌、抗氧 化、抗衰老等生理活性。生物活性肽的研究开发利用 已经成为全球食品和营养等相关领域研究的一个重要发 展方向[1]。
1.3.3 水解工艺条件的优化 利用正交试验设计法，选定温度、p H 值、底物
浓度、酶用量为考察因素，以蚕蛹蛋白水解度为指标， 确定最佳酶解条件。
1.3.4 蚕蛹蛋白活性多肽的分离 参考文献[3 ]、[4]，在最佳酶解工艺条件下进行水
解，水解液 10000r/min 离心 10min，上清液通过截留分
KDY-9810 型凯氏定氮仪 KeTUO 公司；501(A)型 超级恒温器 上海实验仪器厂有限公司；TGL-16G 型高 速离心机 上海安亭科学仪器厂；真空冷冻干燥机 巩 义予华仪器有限责任公司；雷磁 PHS-3C 型精密 pH 计 上海精密科学仪器有限公司；XX80EL005 型超滤设备、 超滤膜(截留分子量 30 万 D、1 万 D，滤膜有效面积为 0.1m2) Milipore 公司；JB-3 型定时恒温磁力搅拌器 上 海雷磁新泾仪器有限公司。 1.3 蚕蛹蛋白多肽的制备