萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质XXX A091100XX生学1101Enzymatic properties of amylases from germinant wheat摘要：在小麦种子中提取淀粉酶，研究相关酶学性质，了解温度、PH值以及激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响，并且对酶的活力进行测定。
不同的温度、PH条件下和加激活剂或抑制剂情况下淀粉酶将淀粉水解的程度不同，产物遇碘呈现不同的颜色，由此可知道酶活性的最适温度和最适PH，也可知道激活剂能使酶的性增加，抑制剂能使酶的活性降低。
对酶的活力进行测定时，是测定产物麦芽糖的量，来表示酶的活力。
麦芽糖能将3、5—二硝基水杨酸还原成棕红色的氨基化合物（520nm处有最大吸收峰），其颜色深浅与麦芽糖浓度成正比，利用分光光度法测定棕红色的氨基化合物吸光值，从而得到产物麦芽糖的量，来表示酶的活力[1]。
关键词：淀粉酶、温度、PH值、激活剂、抑制剂、分光度计研究背景：二十一世纪是生物信息时代，各种生物学领域研究层出不穷 ,对酶的研究是其中一个重要方面,目前对酶的研究已转入了后期，各种酶的生化性质也相继被研究出，酶是一种具有催化活性的蛋白质，由氨基酸通过肽链连接而成,只有在适当的温度、pH和离子强度下才具有生物活性,有些酶还需要辅酶或者辅因子[2]。
通过此次实验研究，让我们进一步加深对淀粉酶的认识和学习，同时培养我们设计实验的基本思路，学会科学的实验组合，提出合理的实验方案,为以后研究其他种类的酶提供了研究方法和实验依据,也为我们以后更多的设计型实验作好铺垫。
原理：淀粉是植物最主要的储藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷种子，淀粉酶活力最强，其中主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。
两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在PH3.6以下迅速钝化。
β-淀粉酶不耐热，在70°C 15min钝化。
根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中的之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。
本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。
在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。
1、材料与方法1.1材料萌发的小麦种子（Triticum aestivum L.）由东北农业大学生命学院生化教研室提供。
1.2方法1.2.1标准曲线的制作取6支试管，编号，按下表加入试剂1.2.2淀粉酶粗酶液的提取称取2g萌发3d的小麦种子，置于研钵中，加入少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨匀浆。
倒入25ml具塞刻度的试管中，用蒸馏水稀释至刻度线处，混匀后在室温下静置，每隔数分钟震荡一次，放置20分钟后，开始离心（4000r/min）10分钟，取上清液备用。
1.2.3定性法分析温度对酶活性影响取8支试管分别编号A、a、B、b、C、c、D、d；分别在A、B、C、D管中加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸1ml，淀粉溶液2.5ml；分别在a、b、c、d管中加入淀粉酶提取液1ml；分别把A、a管放在4℃冷冻箱中，把B、b管放在室温下，把C、c管放在40℃水浴中，把D、d管放在沸水浴中，10min钟后把A管中的溶液倒入a管，把B管中的溶液倒入b管,，把C管中的溶液倒入c管，把D管中的溶液倒入d管，再把a管放在4℃冷冻箱中，把b管放在室温下，把c管放在40℃水浴中,把d管放在沸水浴中，进行酶促反应10min；最后在a、b、c、d管中加入碘液各3滴,并观察颜色变化情况。
1.2.4定性法分析PH值对酶活性影响取三支试管分别编号1、2、3， 3支试管中分别加入PH=3.0、PH=5.6、PH=9.6的缓冲液柠檬酸2ml；再在各管中加入淀粉溶液2.5ml，淀粉酶提取液1ml；混匀；放在40℃水浴中进行酶促反应10min,各加入碘液3滴，并观察颜色变化情况。
1.2.5定性法分析激活剂或抑制剂对酶活性影响取三支试管分别编号1、2、3，,各管中分别加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸2ml；在1管中加入0.3%的NaCl溶液1m，在2管中加入0.3%的CuSO4溶液1ml，在3管中加入蒸馏水1ml；再向各管中加入淀粉溶液2.5ml，淀粉酶提取液1m；混匀；放在40℃水浴中进行酶促反应10min,各加入碘液3滴，并观察颜色变化情况。
1.2.6测定小麦种子不同部位α-淀粉酶的活力取3支试管分别编号1、2、3，向各管中加入淀粉原液1ml，置于70℃水浴15min，冷却至室温。
在1号试管中加入3,5-二硝基水杨酸2ml，将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min，在各试管中加入1%淀粉酶1ml，在40℃恒温水浴中准确保温5min，在2、3号试管中加入3,5-二硝基水杨酸2ml；摇匀；显色后进行比色测定光密度，记录测定结果。
1.2.7测定小麦种子不同部位总淀粉酶的活力取3支试管分别编号1、2、3，向各试管中加入淀粉酶溶液1ml，在1号试管中加3,5-二硝基水杨酸2ml，将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min，在各试管中加入1%淀粉酶1ml，在40℃恒温水浴中准确保温5min，在2、3号试管中加入3,5-二硝基水杨酸2ml ；摇匀；显色后进行比色测定光密度，记录测定结果。
2、结果2.1标准曲线 -0.0500.050.10.150.20.2500.51 1.52麦芽糖含量/mg O D 2.2定性法分析温度对酶活性影响从左到右依次是酶在4℃、常温、40℃、90℃条件下碘显色，4℃：酶的活性几乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色；室温：酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈浅蓝色； 40℃：酶的活性达到相对最大，淀粉完全被水解，加入碘液后接近无色；沸水浴：酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色；由此可以看出40℃是小麦淀粉酶的最适温度，温度偏高偏低都会影响酶的活性甚至导致酶失活。
2.3定性法分析PH值对酶活性影响从右到左依次PH为3.0、5.6、9.6PH=3.0：淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深蓝色PH=5.6：淀粉酶活性达到相对最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈无色PH=9.6：酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入碘液后呈浅蓝色由此可以看出pH=5.6是小麦淀粉酶的最适PH，PH值是影响酶活性的主要因素，通常各种酶只在一定的PH范围内才表现出活性。
2.4定性法分析激活剂或抑制剂对酶活性影响空白对照组：加入碘液后几乎呈无色加NaCl的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈无色加CuSO4的溶液：淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深蓝色由此可以看出NaCl是小麦淀粉酶的激活剂；CuSO4小麦淀粉酶的抑制剂2.5 萌发小麦种子不同位置α-淀粉酶和总酶活力的测定（1）小麦种子的芽：OD（0）=0.000 OD（1）=0.058 OD（2）= 0.080 OD（3）=0.069根据公式：α-淀粉酶活性(麦芽糖/g鲜重/min)=得小麦种子芽淀粉酶活性=3.520mg/g min （2）小麦种子的麦粒OD（0）=0.000 OD（1）=0.009 OD（2）=0.044 OD（3）=0.062根据公式：淀粉酶活性(麦芽糖/g鲜重/min)=得小麦种子的麦粒淀粉酶活性=72.59mg/g min（3）小麦种子的根OD（0）=0.000 OD（1）=0.017 OD（2）=0.033 OD（3）=0.034根据公式：-淀粉酶活性(麦芽糖/g鲜重/min)=得小麦种子的根淀粉酶活性=1.200mg/g min（4）小麦种子的芽OD（0）=0.000 OD（1）=0.030 OD（2）=0.010 OD（3）=0.021根据公式：总淀粉酶活性(麦芽糖/g鲜重/min)=得小麦种子芽总淀粉酶活性=6.5mg/g min（5）小麦种子的麦粒OD（0）=0.000 OD（1）=0.006 OD（2）=0.099 OD（3）=0.076根据公式：总淀粉酶活性(麦芽糖/g鲜重/min)=得小麦种子的麦粒总淀粉酶活性=152.720mg/g min（6）小麦种子的根OD（0）=0.000 OD（1）=0.020 OD（2）=0.040 OD（3）=0.039根据公式：总淀粉酶活性(麦芽糖/g鲜重/min)=得小麦种子的根总淀粉酶活性=0.728mg/g min3、讨论3.1 意义生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的,酶有两种功能:其一,催化各种生化反应,是生物催化剂;其二,调节和控制代谢的速度、方向和途径,是新陈代谢的调节元件。
酶对细胞代谢的调节主要有两种方式:一是通过激活或抑制以改变细胞内已有酶分子的催化活性;另一种是通过影响酶分子的合成和降解,以改变酶分子的含量。
这种酶水平的调节机制是代谢的最关键的调节[3]。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷种子，淀粉酶活力最强，淀粉酶的活性高低可以衡量种子萌发的速率，淀粉酶活性高低可以作为水稻抗逆性的生化指标。
现代酶学正向着两个方向发展：酶的分子生物学和酶工程学，它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括医药，食品，化学工业，诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益[4]。
3.2 方法对比对于酶活力测定的方法有很多,比如测定酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法[2],该法建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测α-淀粉酶活性的方法,此法的实验条件容易控制,重复性好。
组织印渍法在玉米种子吸水约5h后即可检测到α-淀粉酶活性;再如2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷作底物直接测定α-淀粉酶法,该法用新底物2－氯－4－硝基苯－α－半乳糖－麦芽糖苷（Gal－G2－α－CNP）直接测定α－淀粉酶，不需要辅助酶，延滞时间短（＜15s），线性范围宽（可达2200U／L），试剂稳定性好，不使用KSCN、NaN3等激活剂，不受内源性葡萄糖苷酶的干扰，与EPS法对比相关良好[4]。
3.3 研究展望各种α- 淀粉酶作为一种重要的工业用酶, 已经广泛应用于淀粉及淀粉基工业中, 且已经取得了很好的使用效果。
对缩短生产周期, 提高产品得率和原料的利用率, 提高产品质量和节约粮食资源, 都有着极其重要的作用。
但由于不同来源α- 淀粉酶的性质上的差异, 导致了其应用受到一定的局限, 如耐高温α-淀粉酶在高温条件下才能发挥最大活力, 在低温和中温时其利用效率很低, 从而限制了其应用范围。
另外,不同α- 淀粉酶应用于食品中, 其安全性有的尚未完全肯定。
因此, 在以后的研究中, 可以通过化学方法或生物方法对α- 淀粉酶进行改性, 扩展其使用的范围, 提高使用效率。