eflies emit light catalyzed by luciferase with ATP
转入萤火虫 的luciferase 的烟草
GFP- Kac的狗
GFP 老鼠
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、
卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选 动植物转化子的选择标记基因。
外源DNA
PstI酶切
黏性末端
pBR322 4363
PstI酶切 黏性末端
连接酶 重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
影印在含Ap的平板上 空载体转化子(amprtetr)
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
质4-甲基伞形花酮，以此筛选含GUS基因的转化
子。 由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用
于筛选植物转化子。
尤其是GUS基因的3’端与其他结构基因连接产生
的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍 有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的 定位分析。
⑤萤火虫荧光素酶基因（LUC）
LUC表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的
重点：
常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免 疫吸附测定（ELISA）
难点：
免疫印迹（Western Blotting）法的原理
转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 非转化子：未接纳载体或重组分子的转化细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。 非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。 期望重组子：含有目的基因的重组子。 非期望重组子：不含有目的基因的重组子。
筛选植物转化细胞常用的报告基因
报告基因（reporter gene）：系指其编码产物能 够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经 成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表 达活性的一类特殊用途的基因。
报道基因（reporter gene)
（1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖苷酸酶 （β-D-glucuronidase，GUS）；
作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形 成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧 化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态 的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检 测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好 用的一种报告基因。
Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不 存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所 造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰， 因此，Luc是一种理想的报告基因。
选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
蓝白菌落
筛选白色菌落
3.噬菌斑筛选法
噬菌斑(plaque)
噬菌斑是指在 宿主细菌的菌 苔上，噬菌体 使菌体裂解而 形成的空斑。
4.载体提供选择动植物转化细胞常用的标记基因
（2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）；
（3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。
（4）其它
几种报道基因的作用原理
紫外光照
GFP
发绿色荧光
4-甲-β-D-葡萄糖苷酸 GUS 荧光产物
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸 GUS
8.1 遗传学检测法
一、利用载体提供的表型特征筛选重组体
1 抗药性标记及其插入失活选择法
原理： pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应。
对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是 重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。
pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素抗性基因 Tetr ： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因 Ampr ： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能
抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植 物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。
③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选
动植物转化子的标记基因。
④β-葡萄糖酸酶基因（GUS）
GUS的基因产物β-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化
4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物
无环丝氨酸培养基
氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
2.蓝白斑筛选法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因 组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
8 重组体的筛选和鉴定
筛选（Screening） 遗传表型（phenotype）：是生物体遗传组成同环境 相互作用所产生的外观或其他特征。
本章教学目的和要求：
掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶 联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹（Western blotting）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道 基因筛选法。