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ICH关于生物分析方法确证十年总结 2000年1月12~14
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SPSS的实现
Standard curve fitting is determined by applying the simplest algorithm (model) which best describes the concentration-response relationship using appropriate weighing and statistical tests for “goodness of fit” requirement.
浓 度 响应 值
400000.0 350000.0 300000.0 250000.0 200000.0 150000.0 100000.0 50000.0 0.0 0 10 20 30 浓度 40
浓度 w=1 w=1/ 浓度 w=1/ 浓度 *浓度 50 60
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系数分别为C0,数 k后 对 a、 b、 r值 并无影响 ，所 以关键 是确 定各 个值 之间 的相 对比 例关系。通常采用最 多 的是 Wi=k/xi2或 Wi=k/yi2， n目标是通过 选择 权重 因子 使 min∑ 〔(yi-＾ yi)/＾ yi〕 2。 由 于＾ yi值预先未知，这里 的假定条 件是＾ yi值与 xi值或 yi值 呈 正比 。这样也非常便于用电脑处 理数 据。 在某些情 形 下 ，按 Wi=k/xi2或 Wi=k/yi2确 定 权 重因子显得对标准曲线 上 低浓度点 加权过重，导致高 浓度点测量值准确性损失 过 多。 可适 当降 低低 浓度点的 权重，还 可按 Wi=k/xi或 Wi=k/yi确 定权 重因子。 总之 ，权 重因子有 多种 模式 ，可 根 据每 种分 析方法的测量结果 作出 选择 调整 ，然 后确 定 下 来。
n n
The simplest model that adequately describes the concentration-response relationship should be used. Selection of weighting and use of a complex regression equation should be justified. The following conditions should be met in developing a calibration curve: 20% deviation of the LLOQ from nominal concentration 15% deviation of standards other than LLOQ from nominal concentration 偏差=[(实测值－标示值)/标示值]X100%
权重直线回归的计算方法
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生物样品具有含量变化大的特点，需检测的浓 度范围宽，若使用了不恰当的回归计算方法， 会得不到最佳的标准曲线，甚至导致错误的计 算结果。 准确度
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常用回归方法的局限性
n普通最小二乘法是应用较广的建立标准曲线的回归方法。 n运算目标是使得观测值 ( yi) 对回归直线上对应估计量 ( ＾ yi) 偏差平 方和最小，即 min∑ (yi-y^i)2。这意味着标准曲线上每个浓度点的绝 对误差都有同等重要性。 n对于生物方法来 说 ， 经验 和 理论 都 表明 ，生物样品测 试 的绝对误 差会 随 着浓度 增加而增加， 在 需检测的浓度范围 为几十倍 甚至 几百 倍时 ，使用普通最小二乘法 进行 回归， 获 得的标准曲线 必然导致在 低 浓度 区域 测量值的 相对误差甚大 (见下页例子 )。 n即使标准曲线的 相关系数达 到 3个 9以 上， 它在低 浓度 区域 的准确 度有 时依然 不 高 ， 因此 不 能光从 标准曲线 相关系数接近 1的 程 度来 判断标准曲线的 好坏 。
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BAPP的实现
Coeff icien tsa, b Unstandardized Coe fficie nts B Std. Error (Constant) -6.00E-02 .057 X 1.132E-04 .000 Standardized Coefficient s Bet a .999 Model 1 t -1.046 63.920 Sig. .330 .000
线性回归-最小二乘法
浓度 响应值 加入浓度 检测浓度 1956.9 5081.4 9627.9 20005.1 44580.5 93451.7 171291 277264.9 428293.1 0.2 0.5 1 2 5 10 20 30 50 -0.04 0.32 0.84 2.04 4.87 10.50 19.46 31.66 49.05
权重因子的选择 FDA Bioanalytical Method Validation
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化学药物制剂人体生物利用度和 生物等效性研究技术指导原则
n标准曲线各 浓度点的 实测值与 标示 值之 间的偏差 在可 接 受 的范围之 内时 ，可 判定 标准曲线 合格 。可 接受 范围 一 般规定 为最 低浓度点的偏差在 ±20% 以内 ，其 余浓度点 的偏差 在± 15% 以内 。只 有合格 的标准曲线才 能对 临床 待 测样品进行定 量计算。 n当线性范围较宽的时 候， 推荐 采用 加权 的方法对 n标准曲线进行计算， 以使 低浓度点计算得比 较准确 n 偏差 =[（ 实测值－ 标示 值） /标示 值]X100%
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见EXCEL
a. Dependent Variable: Y b. We ighte d Least Square s Re gre ssion - Weight ed by VAR00003
n
Y=0.00011322*x-0.059988 r=0.99914
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n n
C=0.00011515 A -0.26462 R=0.9991
浓度响应 值
450000.0 400000.0 350000.0 300000.0 250000.0 200000.0 150000.0 100000.0 50000.0 0.0 0
浓度响应 值
浓度 w=1
14000.0 12000.0 10000.0 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 浓度 w=1
20 浓度
40
60
0
0.5
1 浓度
1.5
2
n ) Re = ∑ ( yi − yi )2 绝对误差平方和最小 i =1
1
两条直线回归法
n对普通最小二乘法的 改良 ，它将浓度范围分为2个区间，每
n
在实验观察值中，高、低血药浓度值相差较大 时，Re值的大小往往过分取决于高浓度的观察 值，而忽视了低浓度值的观测作用。例如，同 样是0.5的差值，对于100ng/ml相对误差很小， 对于1ng/ml相对误差就很大，所以不能把高低 浓度的差值等同看待。
) n Ci − Ci Re = ∑ C i =1 i

2
相对误差平方和最小
加权最小二乘法
n
加权 最小二乘法是 在回归计算 时增加 了 1个权 重因 子 wi， 即通 过达 到 min∑wi(yi-＾ yi)2 来 求 算回归直 线的斜率和截距。计算时一般使权重与绝对误差成 反比，即将大的权重赋予绝对误差小的点，而小的 权重赋予绝对误差大的点。
， 两条 回归直线 共将 包括 至少 8个浓度点， 其中 第 4点和第 5点 之 间的 区段 为 2个 区间 共有。 在进行未知样品测 定时 ，需 逐个 考虑应用哪 条回归直线计算浓度。 既增加了样品 分析工作 量 ， 又使计算 工作 比较 复杂 。
多项式拟合回归曲线
n高 浓度和极 低浓度下 会有 一些非线性的测定 点， 而当这些 点又 很 有用 时， 采用 多项 式拟 合曲线的回归方法。
n多项式 拟合相关系数 与多项式 阶数 有关 ，当 阶数 和回归点 数一
致 时， r=1。通常 方法是增 设二 次项 ，即 采用 y=a+bx+cx2 的 形式 ，来代替普通最小二乘法 求算。
n缺 点：
n1、 对于不呈 线性 关系 的标准曲线，规 范要 求 n≥8个的浓度点
来确定 浓度 与响 应的 关系 ，使得测 试和计算的工 作量 增加 。 n2、如果这种 回归运算 仍旧是 以 min∑ (yi-＾ yi)2为 目标， 则同样 不 能很好的 解决低浓度区域分 析结果相 对偏差大的问题。
浓 度响 应 值
线性回归 – 权重最小二乘法
450000.0 400000.0 350000.0 300000.0 250000.0 200000.0 150000.0 100000.0 50000.0 0.0 0 20 浓度 40 60 浓度 w=1/c2 14000.0 12000.0 浓 度响 应 值 10000.0 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 0 0.5 1 浓度 1.5 2 浓度 w=1/c2
2
450000.0
浓度响应值 1956.9 5081.4 9627.9 20005.1 44580.5 93451.7 171291 277264.9 428293.1 浓度 0.2 0.5 1 2 5 10 20 30 50
w=1 accuracy w=1/浓度 accuracy w=1/浓度 2 accuracy -0.04 -19.7 0.16 80.7 0.19 96.3 0.32 64 0.52 103 0.53 106.4 0.84 84.3 1.03 103 1.03 102.6 2.04 101.9 2.20 110.2 2.15 107.7 4.87 97.3 4.99 99.7 4.83 96.5 10.50 104.9 10.52 105.2 10.14 101.4 19.46 97.2 19.33 96.6 18.60 93 31.66 105.5 31.33 104.4 30.13 100.4 49.05 98.1 48.43 96.8 46.55 93