来稿日期:20080831 基金项目:邯郸学院硕士博士启动基金(S2006002) 作者简介:葛水莲(19802),女,河北保定人,邯郸学院生物科学系教师,硕士.植物抗旱基因工程的研究进展葛水莲1,薛晶晶1,陈建中2(11邯郸学院生物科学系,河北邯郸056005;21邯郸市植物研究所,河北邯郸056005) 摘要:就植物的抗旱基因包括渗透调节,保护酶体系,抗旱基因及遗传特性等方面对植物抗旱机理的研究进行了综述.研究植物的抗旱性基因,有助于了解植物的抗旱机制,为中国节水抗旱农业的研究提供一些新的思路和新的手段.关键词:抗旱机理;水分胁迫;基因工程中图分类号:S 33214 文献标识码:A文章编号:167321492(2008)0620028204 干旱已是世界性的问题,世界干旱,半干旱地区已占陆地面积的三分之一以上,干旱对植物的影响在诸多自然逆境因素中占首位.显然,对植物抗旱机理的研究显得尤为重要.在长期的进化过程中,高等植物通过一系列生理变化来响应环境的水分胁迫.这些变化体现在渗透调节,保护酶体系,抗旱基因与遗传特性等方面.随着现代分子生物学与生物技术的发展,植物如何通过细胞感受逆境信号、传导逆境刺激、激活一系列分子途径并调控相关基因表达和生理反应以适应逆境,已成为科学家研究的热点[1].本文对上述几方面的研究进行了综述,旨在总结植物抗旱的新机制,以利于我们更好的进行抗旱工作.1　渗透调节中脯氨酸的调节111　植物体内脯氨酸的合成脯氨酸是一种小分子的渗透物质,是水溶性最大的氨基酸,许多植物受到盐渍时积累高水平的脯氨酸.植物的脯氨酸合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫细胞内脯氨酸浓度调控的生理生化过程[2].脯氨酸积累可能是植物受到胁迫的一种信号.遭受胁迫的植物细胞内大量积累脯氨酸,已证明植物体内存在2条脯氨酸合成途径,根据起始氨基酸命名为Glu 途径和Orn 途径[3].胁迫导致水分亏缺时植物体内脯氨酸积累主要依靠Glu 途径,谷氨酸途径发生在胞质中,但脯氨酸降解为吡咯琳252羧酸(P5C )却发生在线粒体中,由脯氨酸脱氢酶(ProD H )催化,这种代谢的区室化分布避免了物质的无效循环.在正常情况下,脯氨酸作为一种反馈调节物质抑制了P5CS 的基因表达而诱导了ProD H 的基因表达.在胁迫条件下,P5CS 基因的表达活性超强,而ProD H 基因的表达活性却受到抑制.植物体内另一条脯氨酸合成途径为Orn 途径.鸟氨酸是在鸟氨酸6-氨基转移酶(62OA T )的作用下,生成谷氨酸半醛(GSA ),后通过Glu 途径生成脯氨酸[4].两条途径因植物和生长时期不同而各自起着重要的作用.从整体来说,在个体发育的早期阶段,异养型营养占优势,Orn -Pro 途径在脯氨酸合成中起重要作用,而谷氨酸作为脯氨酸合成的起始底物显然存在于个体发育的整个阶段,具体来说脯氨酸合成过程究竟是哪条途径居于主导地位有待研究.Roo sens [5]等研究表明,在盐胁迫和正常条件下,幼小植株的62OA T 活性和mRNA 都稍微高于较老植株,且该基因的表达与盐胁迫和脯氨酸产物密切相关.在拟南芥幼小植株中,游离脯氨酸含量、62OA T 活性以及62OA TmRNA 都受到盐胁迫处理而增加,这些结果表明对于拟南芥植物来说,在渗透胁迫过程中鸟氨酸途径和谷氨酸途径一样在脯氨酸的累积中发挥着重要的作用.另一方面4周龄的拟南芥植物虽然游离氨基酸的水平在盐胁迫条件下有所增加,但62OA T mRNA 的表达却没有检测到,相反P5CS mRNA 表达却达到较高水平.因此对于成年植株来说,游离脯氨酸的增加似乎只・82・第24卷第6期2008年12月 (自然科学版)Journal of Hebei North University (Natural Science Edition ) Vol 124No 16Dec.2008是由于谷氨酸途径的酶活性引起的.112　脯氨酸合成酶系分子生物学研究现状11211　脯氨酸合成酶研究现状　脯氨酸合成酶属于一个基因家族,在植物体内脯氨酸的合成由谷氨酸或鸟氨酸开始.在谷氨酸途径P5CS是一个双功能酶,具有谷氨酸激酶(72GK)和谷氨酰272半醛脱氨酶(GSAD H)活性,催化脯氨酸合成过程中的前2步反应,它是脯氨酸合成的限速酶;在鸟氨酸途径中,通过r2谷氨酰磷酸,GSA和P5C形成脯氨酸,62OA T是其限速酶.植物利用外源脯氨酸时Pro T起主要作用.与脯氨酸积累有关的酶主要有3类:谷氨酸途径中的P5CS和吡咯琳252羧酸还原酶(P5CR)、OA T、PSCR和Pro T.11212　脯氨酸合成酶基因分子生物学研究　编码脯氨酸合成酶基因的研究较为深入,至今已从水稻、黑麦、绿豆、大豆、拟南芥、蒺藜、苜蓿、榆钱、菠菜等植物中克隆出了多个与脯氨酸合成酶相关的基因,其中包括P5CS、PSCR、OA T和Pro T[627].鸟氨酸循环中62OA T基因已在大豆、苜蓿、拟南芥等中得到克隆.转运蛋白Pro T基因在拟南芥、番茄、水稻、大麦等中得到克隆. WU[8]研究发现,在拟南芥中P5CS是由2个不同调节基因编码的.该基因有l9个内含子和20个外显子定位于2号染色体7815位置上的At P5CS1基因可以在大多数植物器官中表达,但在分裂细胞中沉默;定位于3号染色体l0113位置上的At P5CS2基因转录产物,占植物组织中P5CSmRNA总量的20%～40%,并在分裂细胞中负责合成P5CSut RNA,At P5CS转录产物的积累具有组织特异性.同样在番茄的核基因组中,也发现有2个脯氨酸基因座(1oci):一个是特异性双功能tom Pro2基因座;另一个基因座为tom Prol,该基因座编码一个多顺反子mRNA,指导72GK和GSAD H2种多肽的合成[9].P5CS基因广泛存在于单子叶和双子叶植物中;P5CR基因有7个外显子,6个内含子,用探针将其定位于拟南芥的5号染色体上;62OA T基因有l0个外显子,9个内含子,该基因定位于拟南芥的5号染色体上;脯氨酸转运蛋白的基因有8个外显子,7个内含子,该基因定位于水稻的3号染色体上,在拟南芥中脯氨酸转运蛋白是2个不同调节基因编码的,该基因有7个内含子6个外显子,定位于2、3号染色体上. 11213　脯氨酸在转基因植物中的表现　将P5CS 和62OA T分别转入烟草植株中,发现在转基因烟草(N icoti ana t abacum)中脯氨酸含量明显提高且与对照相比,耐盐性也有所提高,转入其他植物也得到同样的结论.将从乌头叶豇豆中克隆的P5cs基因与CaMV35S启动子连接后转入烟草中,发现转基因烟草的脯氨酸含量比对照高10～18倍.在干旱胁迫下转基因烟草落叶少且迟.将拟南芥的62OA T基因导入烟草,使脯氨酸累积增加2倍,转基因的幼苗可在200mmol/L NaC1中正常生长;将此基因导人烟草,使脯氨酸累积增加2倍,转基因的幼苗可在200mmol/L NaC1中正常生长.杨成民[10]从豇豆中分离到的P5CS为目的基因,通过基因枪与选择标记bar基因共转化获得转基因黑麦草再生植株.K ishor[11]等将P5CS基因导入烟草,转基因植株脯氨酸含量比对照高10～18倍;在盐胁迫条件下,与对照相比转基因植株根的长度和干重增加,植株生物产量提高花发育得更好,果荚数目和每荚的种子数也增加.干旱条件下植物体内脯氨酸积累是否有利于植株抗旱,目前存在相当大的争议.尽管对于许多植物来说,脯氨酸的积累在逆境中的生理机制还未完全清楚,但普遍认为在干旱胁迫下脯氨酸的升高有利于植物对干旱胁迫的抵抗,耐旱植物(品种)通比不耐旱植物(品种)具有较强的脯氨酸积累能力,这些积累的脯氨酸通过质量作用定律进行渗透调节,从而增强植株保水能力.李燕等[12]在皂角苗木对干旱胁迫的生理生化反应的研究中发现,在干旱胁迫下,皂角的脯氨酸含量先增后减,这种变化趋势在一定程度上反映了脯氨酸在干旱胁迫下对植物体内氨积累所造成的毒害发挥消除作用.在干旱条件下植物各器官脯氨酸的积累存在差异.Bajji等发现滨藜中脯氨酸含量的增加在叶中较显著,对根没有显著影响.也有研究发现,根的脯氨酸增加的幅度比茎叶中都大[13].2　保护酶体系保护酶体系包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CA T)和抗坏血酸过氧化物酶(AsP)等,它们协同抵抗干旱胁迫诱导的氧化伤害.其中SOD酶可以催化O22,发生歧化作用起着清除O22的解毒作用,而CA T, POD,ASP能够清除歧化作用产生的H2O2造成的伤害.在整个防御系统中SOD是所有植物在氧・92・2008年12月葛水莲等:植物抗旱基因工程的研究进展第6期化作用中起重要作用的抗氧化酶.根据其结合的金属离子的不同.SOD 可分为Cu/Zn 2SOD 、Mn 2SOD 和Fe 2SOD 三种类型.Cu 2SOD 主要在叶绿体和细胞质中,Mn 2SOD 主要存在于线粒体中,Fe 2SOD 则主要存在于叶绿体中.将烟草的Mn 2SOD 2cDNA 导入苜蓿后,转基因苜蓿的抗旱性得到了提高,将Mn 2SOD 基因定位到烟草的叶绿体和线粒体上,发现也能表达其基因.进一步研究发现,在叶绿体中Mn 2SOD 的过量表达使烟草受干旱所引起的氧化伤害程度比对照明显减轻,但线粒体中增加的Mn 2SOD 活性对烟草耐氧化胁迫能力没多大影响.另外,表达拟南芥Fe 2SOD 的转基因烟草、表达番茄Cu/Zn 2SOD 的转基因烟草、过量表达豌豆Cu/Zn 2SOD 的转基因烟草均能增强抵抗干旱引起的氧化胁迫能力.3　植物抗旱基因与遗传的研究311　保护生物大分子及膜结构的蛋白质31111　水通道蛋白(aquapofin )　水通道蛋白是指作为跨膜通道的主嵌入蛋白(M IP )家族中具有运输水分功能的一类蛋白质,能够促进和调节水分跨膜的被动交换,包括植物体内的跨细胞和胞内水分流动,是水分跨膜运输的重要途径之一.水通道蛋白属于主要内在蛋白家族成员,最早在哺乳动物的某些特殊的细胞类型里发现的如红细胞肾小管细胞等.在植物体内,水通道蛋白分布于液泡膜上的液泡膜嵌入蛋白(TIP ),分布于细胞质膜上的胞质膜嵌入蛋白(PIP )和根瘤细胞中.大多数水通道蛋白在维管组织和幼嫩组织的细胞中表达显著.目前对于水桶道蛋白基因的研究还有待于进一步发展.31112　调渗蛋白　在高盐浓度下,培养的烟草细胞中多种蛋白质的含量发生了变化.其中一种分子量为26KD 的蛋白质的增加尤为显著.高达细胞总蛋白量的12%以上.该蛋白的积累则要求氯化钠或低水势的存在[14].除烟草外其它一些植物西红柿、马铃薯、胡萝卜、棉花、小米和大豆的培养细胞经ABA 处理后也出现了同OSM 起免疫交叉反应且分子量约为26KD 的蛋白质.这表明OSM 可能是一种普遍存在于高等植物的蛋白质.目前已得到由农杆菌介导将OSM 的启动子和B 2葡萄糖苷醛酶(GU S )报告基因嵌合在一起的转基因烟草.31113　胚胎后期发生丰富蛋白(L EA 蛋白)　在种子后期发育过程当中,L EA 蛋白随种子的脱水成熟其含量增加.在胁迫条件下L EA 蛋白在植物细胞中起保护作用,这种保护作用对于植物在极端压力条件下是必要的.根据L EA 的结构[15]推测L EA 蛋白可能有以下三方面的作用:1)作为脱水保护剂.由于L EA 蛋白在结构上富含不带电荷的亲水氨基酸,它们既能像脯氨酸那样,通过与细胞内的其它蛋白发生相互作用,使其结构保持稳定,又可能给细胞内的束缚水提供了一个结合的衬质,从而使细胞结构在脱水中不致遭受更大的破坏.2)作为一种调节蛋白而参与植物渗透调节.3)通过与核酸结合而调节细胞内其它基因的表达.312　编码抗旱转录因子的调节基因由于在逆境条件下与逆境相关的转录因子能跟调节功能基因的表达和信号转导,它们在转基因植物中的过量表达会激活许多抗逆功能基因同时表达,因此可提高植物的耐旱性.DREB 是目前研究较多的抗非生物胁迫的转录因子.Xiong [16217]利用差示显示法从干旱处理的拟南芥中克隆了一批受干旱诱导的基因rd 基因,对rd29A 基因启动子进行分析揭示了一个与干旱、高盐及低温胁迫应答基因有关的DRE 顺式作用元件,并克隆了3个与DRE 元件结合的转录因子,用干旱或高盐处理10min ,DREB2A 和DREB2B 被快速强烈诱导,并且不受外源ABA 的诱导.Hara [18]利用CaMV35S 启动子和逆境诱导特异启动子rd29A ,将DREB1A 的cD 2NA 导入拟南芥,DREB1A 的过量表达激活许多耐逆境功能基因的表达如rd29A 、K inl 、Con5a 、Cor6和P5CS 等转基因植株耐旱性、耐盐性和耐冻性提高.4　展　望近年来植物抗旱、耐盐碱基因工程的研究受到了越来越广泛的关注和重视.中国北方地区土壤干旱、盐渍化是影响农牧生产的重要因素.通过筛选与植物的抗旱性、抗盐碱性相关的基因,研究其功能,揭示其相关因子的信号转导途径,采用现代生物技术手段进行转基因育种、获得耐早和耐盐碱能力强的新品种已成为解决我国中西部干旱、半干旱地区农牧业发展种质资源矛盾的有效手段之一.目前利用基因工程技术培育抗旱品种主要有两种策略:1)增加植物渗透性代谢产物的合成能力,使植物在水分胁迫下能合成更多的渗透调节物质如脯・03・2008年12月 河北北方学院学报(自然科学版) 第6期氨酸,甘露醇、甜菜碱、海藻糖等,以提高植物的渗透调节能力,从而增强植物的抗旱性;2)增强植物对活性氧自由基的清除能力,使植物在水分胁迫下过量表达一些酶(如SOD,POD,CA T等),以有效地排除有害的活性氧自由基,从而提高细胞耐脱水的能力[19220].在通过基因工程方法进行抗旱分子育种的过程中发现存在一些问题:1)由于人们对植物抗旱的分子机制缺乏了解,抗旱分子育种还有很大的盲目性;2)采用单基因策略提高植物的抗旱性对有的基因和植物有效,对有的基因和植物却无效;3)利用35S启动子与抗旱基因组合在提高植物抗旱性的同时也造成植物畸形发育;4)外源基因表达水平不稳定.尽管目前抗旱分子育种面临不少的问题,但随着抗旱分子生物学研究的深入和生物技术的进步,相信不久的将来会有大量的抗旱基因作物应用到生产实践中来.参考文献:[1]Blum A.Drought 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