– 一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。
引物设计软件
Primer Premier 5.0
– 生物软件网下载 – 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU
改为vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer
– GC含量太低导致引物 含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 值较低， 含量太低导致引物 值较低
的退火温度不利于提高PCR的特异性 的特异性 的退火温度不利于提高
– GC含量太高也易于引发非特异扩增。 含量太高也易于引发非特异扩增。 含量太高也易于引发非特异扩增
引物Tm值 引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。 一般要求：55℃-65℃。 计算： 计算：
引物的保守性与特异性
保守性：通用引物 保守性：通用引物——检测同一类病原 检测同一类病原 微生物尽可能多的型别 特异性： 特异性：避免非特异性扩增
扩增区域的二级结构
模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构， 模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构， DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构 在选择引物时， 在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些 区域。 区域。
引物长度
一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR 个核苷酸，在做长片段 一般为 个核苷酸 或做某些特殊的PCR时应使用较长的引 时应使用较长的引 或做某些特殊的 个核苷酸。 物，但最多不超过50个核苷酸。 但最多不超过 个核苷酸
碱基分布的均衡性
同一碱基连续出现不应超过5个 同一碱基连续出现不应超过 个 GC含量一般 含量一般40-60% 含量一般
物素、地高辛等）。 物素、地高辛等）。
引物的内部稳定性
过去认为，引物 端应牢牢结合在模板上才能 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能 有效地进行延伸， 端最好为G或 。 有效地进行延伸，故3’端最好为 或C。 端最好为 现在的观点认为，引物的 端应是相对稳定结 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结 构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定 端在碱基配对的情况下最好为低稳定 性结构， 端尽可能选用A或 ，少用G或 。 性结构，即3’端尽可能选用 或T，少用 或C。 端尽可能选用
引物与PCR 引物与PCR
引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L
– 引物浓度(uM)=n OD×33/（A×312＋C×288＋G×328
＋T×303-61）/VH2O
VH2O (单位：L)
退火温度
– 最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 ×(Tm of primer) + 0.7
× (Tm of product) – 25
如何使用Primer 如何使用Primer Premier 5.0
引物设计
–一般引物设计 –5’带酶切位点引物设计 带酶切位点引物设计 –巢式PCR引物设计 巢式PCR PCR引物设计 –多重PCR引物设计 多重PCR PCR引物设计
探针设计 引物评析
引物同源性分析
用Blastn软件进行同源性比较 Blastn软件进行同源性比较
– 仅仅 端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低 仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低
稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。 稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。
– 如果3’端为富含 、C的结构，只需3’端几个碱基与 如果 端为富含G、 的结构，只需 端几个碱基与 端为富含 的结构
模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。 模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。
位点5 端加上适当数量的保护碱基 端加上适当数量的保护碱基）。 位点5’端加上适当数量的保护碱基）。
–5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产 端的某一位点修改某个碱基， 端的某一位点修改某个碱基
物中引入该位点的点突变以作研究。 物中引入该位点的点突变以作研究。
–5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生 端标记放射性元素或非放射性物质（ 端标记放射性元素或非放射性物质
引 物 设 计
引物 引物的重要性 引物设计的原则 引物与PCR 引物设计软件 如何使用Primer Premier 5.0 引物同源性分析
引物（primers) 引物（primers)
引物是人工合成的两段 寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。 5’ 3’ Sense primer
H/(△ Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物二级结构
引物二聚体
–尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多 尽可能避免两个引物分子之间3 端有有较多
碱基互补
发夹结构
–尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则 尤其是要避免引物3 端形成发夹结构 端形成发夹结构，
–对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 20个碱基的引物
Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
–对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参
数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也 最近邻位”的计算方式得到， 是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
→
5’
Antisense primer
←
3’
引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的 地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA 特异结合，不与其他非目的DNA结合， PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物 进行有效的延伸，可见引物设计好坏与 PCR结果密切相关。
引物设计原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
–尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作

为引物
–选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引 选择3 端与非目的基因不同源的序列作为引
物
–选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源 选择两个引物3 端与同一非目的基因不同源
的序列作为引物
引物5 引物5’端
引物5 端可以有与模板DNA不配对碱基 端可以有与模板DNA不配对碱基， 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基， 端引入一段非模板依赖性序列。 在5’端引入一段非模板依赖性序列。 端引入一段非模板依赖性序列
–5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切 端加上限制性核酸内切酶位点序列（ 端加上限制性核酸内切酶位点序列
将严重影响DNA聚合酶的延伸。 将严重影响DNA聚合酶的延伸。 DNA聚合酶的延伸
引物3 引物3’端
引物的延伸从3 端开始 因此3 端的 端开始， 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的 几个碱基与模板DNA均需严格配对， 几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能 DNA均需严格配对 进行任何修饰， 进行任何修饰，否则不能进行有效的延 伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到 甚至导致PCR扩增完全失败。 PCR扩增完全失败 密码子的简并性，引物3 端最后一个碱 密码子的简并性，引物3’端最后一个碱 基最好不与密码子第三个碱基配对。 基最好不与密码子第三个碱基配对。
–扩增区域的自由能（△G。）小于 扩增区域的自由能（
58.61kJ/mol
– 引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃ 引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃ Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过
Tm
product
= 81.5 + 16.6 log
([K+]/(1+0.7[K+])) + 0.41 (%G + %C) 500/lengt