第一节 大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系 克隆基因正确表达的基本条件
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
基因工程的重要目标之一是，制备按其它方法难以生产 的大量纯化的蛋白质产物，为此就需要有一种能够高水平表 达异源蛋白质或重组蛋白质的表达系统。而良好的表达系统 的选择要考虑多方面的因素，如寄主细胞的生长特性、蛋白 质产物转译后的修饰与生物活性，以及异源蛋白质的表达水 平和分泌方式等。目前被选作表达异源蛋白质的表达系统有 细菌（包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、酵母、昆虫、植物 和哺乳动物细胞等。
➢ 培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生 产。
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大肠杆菌表达体系
大肠杆菌中表达体系表达真核基因的不足：
➢ 真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别，在 大肠杆菌细胞中不可能具有为真核RNA加工剪辑所需要的 酶体系，真核基因很难直接在大肠杆菌细胞中实现功能性 表达；
➢ 通过引进突变的的方法消除细菌中存在的能降解外源真核 蛋白质的蛋白酶分子。
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克隆基因正确表达的基本条件
最基本条件：能进行正常的转录和翻译，在正常情况下还与 翻译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。 重要条件 ➢ 编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性； ➢ 具有核糖体结合位点； ➢ 具有克隆基因的功能（强）启动子； ➢ 插入序列的正确取向
制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS）； ➢ 标记：有适合的标记，易于选择； ➢ 安全性：要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内 特殊菌种内才可复制等； ➢ 表达：有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达 ，并且尽可能是高效的表达。
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大肠杆菌表达体系
比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性：
➢ 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理 有深刻的了解；
➢ 一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株 和不同类型的载体；
➢ 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、 高水平的表达；
翻译终止子
mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌偏爱终止子 UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下 ，转译终止的效率将进一步的增强。
➢ 真核基因的转录信号同原核不同。细菌的RNA聚合酶不能 识别真核启动子；外源基因可能含有具有大肠杆菌转录终 止信号功能的核苷酸序列。
➢ 真核基因mRNA的分子结构同细菌有所差异，影响真核基 因mRNA稳定性和同细菌核糖体相结合的能力，从而阻碍 正常的转录和翻译；
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大肠杆菌表达体系
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第二节 大肠杆菌的表达载体
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第二节 大肠杆菌的表达载体
大肠杆菌载体系统 大肠杆菌表达载体的基本成分 常用的大肠杆菌表达载体
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大肠杆菌载体系统
➢ 容量：分子较小，可携带比较大的DNA片段； ➢ 复制：能独立于染色体而进行自主高效的复制； ➢ 酶切位点：有尽可能多的多种限制酶切位点，但每一种限
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大肠杆菌克隆载体
Vector plasmid λ phage cosmid P1 phage PACs BACs
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Host
E. coli
E. coli E. coli E. coli E. coli E coli
Insert size (kb) <8 9~24
35~45 70~100 100~300 ≤300
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翻译起始序列
5’-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。
在核糖体结合位点（RBS）的序列结构中，增加腺嘌呤 和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例，诱发碱基发生定点突 变；或使用转译偶联系统进行克隆基因表达
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翻译增强子
显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率
大肠杆菌Lac操纵子的lac启动子，Trp操纵子的trp启动子及
tac启动子，λ噬菌体的PL和PR启动子以及pBR322载体的β内酰胺酶启动子
➢ 从真核细胞中分离完成加工的mRNA，使用反转录酶合成 出cDNA，并连接到适当的载体上，可以克服真核基因的 间隔子问题；
➢ 根据蛋白质的氨基酸序列，应用化学方法合成出不带间隔 序列的寡聚脱氧核糖核酸的短片段；
➢ 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰 （正确折叠和组装），而大多数的修饰作用在细菌细胞中 并不存在；
➢ 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质 分子，将其降解。
2020/ห้องสมุดไป่ตู้/16
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大肠杆菌表达体系
为了克服上述这些问题，已经发展出了许多种不同的方法：
➢ 将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游附近部位，如
中英HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室
基因工程原理
何光源
2016-04-05
第九章 大肠杆菌基因工程
第一节 大肠杆菌表达体系 第二节 大肠杆菌的表达载体 第三节 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达
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第一节 大肠杆菌表达体系
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大肠杆菌表达载体
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大肠杆菌表达载体的基本成分
组成部分 ➢ 启动子 ➢ 转录终止子 ➢ 翻译起始序列 ➢ 翻译增强子 ➢ 翻译终止子
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启动子
最佳启动子具备的条件：
➢ 必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表 达量占细胞总蛋白的10%~30%以上；
➢ 应能呈现出一种低限的基础转录水平，具有高度抑制性（ 抑制型启动子）；
➢ 应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物得以 诱导（诱导型启动子）。
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转录终止子
转录终止子能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质 产物的水平。
启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用， 当其通过下游启动子时，会使该启动子的功能受到抑制，这 种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象