第三章
临床生物化学检验常用技术
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本章内容概要
第一节 光谱分析技术 第二节 电化学分析 第三节 干化学分析技术 第四节 电泳技术 第五节 层析技术 第六节 离心技术 第七节 自动生化分析技术
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教学目标和要求
1、掌握分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。 掌握电化学分析方法基本原理
2、熟悉分光光度计的基本结构和操作方法光源检查 和波长校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析 的因素。熟悉离子选择电极分类，离子选择电极的分 析方法 3、了解其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中 的应用。
A=- lgT=KLC
I/Io为透光率(Transmittance, T) A为吸光度(Absorbance) K为吸光系数(absorptivity) L为液层厚度 C为溶液浓度(concentration)
摩尔吸光系数ε：当溶液层厚度单位为cm，浓度单位为
mol/L时，K即成为摩尔吸光系数
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选择吸收 ----组成物质的分子仅吸收与其内能变化(基
态与激发态能量差)相对应的波长或频率的 光，所得到的光谱称为吸收光谱。
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能，以热或发射光谱的形式将能 量释放出来。所发射出的相应光谱，称分子发 射光谱。
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激发态 发 射 光 谱
散射光谱分析技术：比浊法
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2、光的基本性质---高速传播的电磁波
微粒性(E=hv)
波粒二象性
波动性(=c/v)
E=hv =hc/
----光的能量与光的波长成反比，与
光的频率成正比
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3、物质对光吸收的基本原理：
能量转移
---- 当光 辐射通 过某种 物质时，组成该物质 的分子（原子）与光 子发生“碰撞”，光 子的能量因此转移至 分子（原子）上，使 它们由基态(低能态)跃 迁到激发态(高能态)， 这种跃迁称为激发。
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第一节 光谱分析技术
分光光度技术的基本原理 分光光度计的基本结构 分光光度计的操作方法 分光光度技术的定性和定量方法
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一、光谱分析技术的基本原理：
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征， 以此来确定物质性质、结构或含量。
1、 光谱分析技术分类：
发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱 法和荧光光谱法 吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法， 原子吸收分光光度法和红外光谱法
E1 吸 收 光 谱
基态 E1 ＞E0
E0
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4. 分类
（1）根据产生光谱的物质结构 原子光谱 (atomic spectrum) 分子光谱 (molecular spectrum)
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（2）根据光谱获得的方式不同 ① 吸收光谱（Absorption spectrum）分析法：
根据溶液能吸收由光源发出的某些波长的光后 所形成的特征光谱来鉴定该物质的性质和含量的 方法。
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任 波长单色光的光学系统。 ①入射狭缝：光源的光由此进入单色器； ②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；
④聚焦装置：透镜或 凹面反射镜，将分光 后所得单色光聚焦至 出射狭缝； ⑤出射狭缝。
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3. 样品室
样品室放置各种类型的吸收池 （比色皿）和相应的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻璃池两种。 在紫外区须采用石英池，可见区一 般用玻璃池。
4. 检测器
利用光电效应将透过吸收池的 光信号变成可测的电信号，常用的 有光电池、光电管或光电倍增管。
5. 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行 仪器自动控制和结果处理
将不同波长的两束单色光(λ 1、λ 2) 快束交替通过同 一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。
△=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。
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仪器
可见分光光度计
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仪器
紫外-可见分光光度计
（二）分光光度计的基本结构
光源
单色器
样品室
检测器
显示
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具 有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区：钨灯作 为光源，其辐射波长范 围在320～2500 nm。
紫外区：氢、氘灯。 发射185～400 nm的连 续光谱。
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2.单色器
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可见光： 400~700nm, 有色物质溶液
紫外光： 200~400nm, 无色物质
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2、特点：
仪器设备和操作简单 费用少，分析速度快 灵敏度高(10-4~10-7g/mL) 选择性好 精确度和准确度高
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3、应用：
（1）定性分析 定性鉴定 纯度鉴定 结构分析
（2）定量分析
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（一）光吸收的基本定律 1、定律：
单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液的浓 度和厚度之间呈正比关系。
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（1）Lambert定律： 说明吸收与溶液液层厚度间的关系
入射光
透过光
入射光
透过光
I0
L1
I1
I0
L2
I2
L2 ＞ L1 ，I1 ＞ I2
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（2）Beer定律： 说明吸收与溶液浓度间的关系
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2、表达式： -lgI/Io=-lgT=KLC
根据物质受到热能或电能等的激发后所发射 出的特征光谱来进行定性及定量分析的一种方 法。
原子发射光谱法 (atomic emission photometry)
分子发光分析法
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二 分光光度法 1、定义：
根据被测物质对各种不同波长光的吸收 能力，绘制吸收曲线，并根据曲线的特性 鉴定物质的方法。
属光谱分析法。
紫外-可见分光光度法 (ultraviolet and visible spectrophotometry) 原子吸收光谱法 (atomic absorption spectrophotometry) 红外光谱法 (infrared spectrometry)
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② 发射光谱(emission spectrum)分析法：
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（三）分光光度计的类型
1.单光束
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度， 一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高 的稳定性。
2.双光束
自动记录，快速全波 段扫描。可消除光源不稳 定、检测器灵敏度变化等 因素的影响，特别适合于 结构分析。仪器复杂，价 格较高。
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3.双波长