细胞转染
转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。

常规的转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。

前者外源DNA/RNA不整合到宿主的染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。

一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24—72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。

后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。

尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。

外源DNA整合到染色体中的概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH：新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂的比例、细胞数量、培基及检测时间等。

转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个：
1、转染试剂
不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。

每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最合适实验设计的转染试剂。

当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。

2、细胞状态
一般低的细胞代数（<50代）能确保基因型不变。

最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。

细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。

这会导致和转染相关的细胞行为的变化。

也就是说同一种系的细胞株，在各实验室不同培养条件下，其生物学性状发生不同程度的改变，导致其转染特性也发生变化。

因此，如果发现转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。

3、转染方法
不同转染试剂有不同的转染方法，但大多大同小异、转染时应根据具体转染试剂推荐的方法，但也要注意，因不同实验室培养的细胞性质不同，质粒定量差异，操作手法上的差异等，其转染效果可能不同，应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。

（1）细胞培养物
健康的细胞培养物是成功转染的基础。

不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。

高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。

推荐在转染前24小时分细胞，这将提供正常细胞代数，增加对外源DNA摄入的可能。

一定要避免细菌，支原体或真菌污染。

（2）细胞密度
细胞密度对转染效率有一定的影响。

不同的转染试剂，需求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。

转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。

因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等。

阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果。

不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。

一般转染时贴壁细胞密度为50%~90%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书。

（3）血清
血清一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染，但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。

不过转染产品配方几经革新后，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率，如阳离子聚合物等，血清的存在会影响DNA-转染复合物的形成，但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基或PBS来稀释DNA
和转染试剂就可以了，在转染过程中是可以使用血清的。

不过要特别注意：对于RNA转染，如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。

通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。

血清质量的变化直接影响细胞生长，因此也会影响转染效率。

新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。

（4）抗生素
细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染，但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。

比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。

这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但有些转染试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。

这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。

（5）氮磷比
N/P比是转染效率的关键（为了换算方便，一般以DNA/转染试剂质量比表示），在一定比例范围内转染效率随N/P比成比例增高，之后达到平值，但毒性也随之而增加，因此在实验之前应根据推荐比例，确定本实验的最佳转染比例。

（6）DNA质量
DNA质量对转染效率影响非常大。

一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进度，但对GenEscort系列转染试剂影响不大。

4、载体构建
转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR产物，寡核苷酸等）也影响转染结构。

病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需要考虑一些安全问题（如基因污染）。

除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响。

如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。

转染后的筛选
转染常用的报告基因
报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。

把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。

在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种：
1、胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)
2、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)
3、荧光素酶基因（luciferase Gene）
4、β-D-葡萄糖苷酶基因
5、绿色荧光蛋白（gfp）基因等。

转染和筛选：
1. 使用含编码抗生素抗性基因表达序列的质粒（如pSV2neo）转染细胞。

2. 转染后第二天，将细胞传代，给细胞分裂的空间（根据细胞生长的速度，一般1:10到1:40可以达到效果）。

3. 转染后2-3天，开始使用抗生素。

将转染的细胞在含抗生素的培养基中培养，抗生素的浓度由剂量-反应分析确定。

含抗生素的培养基每周更换两次。

4. 10到14天后，可以观察到抗性克隆，未转染的对照应该没有细胞生长。

可以根据需要固定，染色，传代或克隆抗性细胞。

转染细胞的稳定筛选
1．确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性,因此在筛选前要做预试验,确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度.
①提前24 小时在96 孔板或24 孔板中接种细胞8 孔,接种量以第二天长成25%单层为宜,置CO2 孵箱中37℃培养过夜.
②将培养液换成含抗生素的培养基, 抗生素浓度按梯度递增0,（50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μg/ml）.
③培养10-14 天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为400-800μg/ml,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半.
2．转染按前面的步骤进行.
3．转染72 小时后按1: 10 的比例将转染细胞在6 孔板中传代,换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基.在 6 孔板内可见单个细胞,继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落,此时可用两种方法挑选单克隆.
①滤纸片法：用消毒的5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15 秒,取出粘附有细胞的滤纸片放于24 孔板中继续加压培养. 细胞在24 孔板中长满后转入25cm2 培养瓶中,长满后再转入75cm2 培养瓶中培养.
②有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10 倍稀释（10-2-10-10）,将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养,7- 10天后,选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆.
4. ELISA或Westernblot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种.。