( 3)型特异性探针杂交( LIPA )
将生物素或荧光素标记型特异性探针固化 相化在膜或芯片
与RT- PCR扩增的病毒产物进行杂交 是建立在5’非编码区基础上 有5% ~ 10%的1 a、1 b 型不能鉴别, 也不能区别2 a 和2 c 型。
12
Stuyver L，Wyseau A，Maertens G，et al. Second generadon line probe assay for hepatim C virus genotyping [J]jourhal of Clinical Microbiology，1996；34：2259．
18
Antonishyn NA, Ast VM, McDonald RR. et al.Rap id genotyping of
hepatitis C virus by primer- specific extension analysis [J]. Clin
Microbio,l 2005, 43: 5158- 5563.
. 12: 416- 417
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（8）COMA基因分型法：
原理是基于长异源双链的解链特性不 同．用已知的序列顺序的参考DNA捕获液 相中未知的DNA．
两者形成异源双链杂交体，由这个杂交体 的两条单链间解链曲线的差异可以推断出 其序列差异
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Genotyping HIV-1 and HCV strains by a combinatorial DNA melting assay
subtypes of hepatitis C virus using RFLP of sequences amplified from the
5′non-coding region. J Gen Virol, 1995, 76:1197-1204.
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( 5)遗传发育关系进化树
对一定区域的样本测序结束后可将序列互 相比较
该方法常用的酶为HaeIII、RsaI 、Mva I 、 Hinf I、Scrf I
该方法检测基因型的精确度为97％ 不能区分所有的HCV基因亚型 也不能识别在泰国和越南发现的变异基因
型，
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Davidson F, Simmonds P, Ferguson JC, et al. Survey of major genotypes and
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（7）异源分子迁移率法（HMA）：
用已知不同型的HCV 参比DNA 与未知基 因型的HCV 的DNA 分子混合、变性、退 火, 形成同源、异源分子,
这些分子在PA GE 中迁移率不同, 并同异 源DNA 中不同碱基的数目成比例, 来鉴定 基因型
王林, 徐东平, 张灵霞. 丙型肝炎病毒基因型分型及临床意义[ J]. 肝脏2006,
以阿拉伯 数字表示 HCV 基因 型, 以小 写的英文 字母表示 基因的亚 型(如1 a、 2 b、3 c 等)。
6
HCV 基因型分布
北美: 1, 3, 2 南美: 1, 2, 3 欧洲: 1, 3, 2 非洲: 2, 1, 3, 4, 5, 6 亚洲: 2, 1, 3, 4, 6 中东: 4 中国：1b，2，6
分析样本间序列的进化距离, 画出该区域内 HCV 流行的关系进化树,
观察HCV 在区域内的分子流行情况及特点
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（6）特异引物错配延伸法(PSMEA)：
利用taq酶在引物3‘末端发生错配时无法继 续延伸
借助荧光测量仪检出错配峰出现的频率达 到分型目的
该方法成为检测混合HCV基因型感染的方 法．比直接测序灵敏度高20倍
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HCV 基因分型分类系统
不同的研究者建立并使用各自的HCV 分类系 统
主要的命名系统有: Chan系统、Simmonds 系统、Okamoto 分类系统、Kanazawa命名 系统
第二届HCV 与相关病毒国际讨论会议上, 制定 了统一的命名系统--Simmonds系统,
5
目前认为 主要有6 种HCV基 因型及不 同亚型,
7
HCV 基因分型区域的选择
最准确的方法就是对基因组的某个区进行 PCR 扩增、测序及进化树分析, 选择的区 有NS5、Core、E1和5‘UTR
通常建立在5’ UTR, 因为该区是HCV RNA 诊断实验的常用区域
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基因分型的分子学方法
（1）测序法：测全长或片段 金标准 费时费力 不适于临床
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HCV基因
其基因组为单股正链RNA, 易变异。 全长9. 6 kb 341 b的5‘非编码区( 5’NTR, NCR, UTR ) 27b的3’非编码区( 3‘NRT )。 在病毒复制中, 氨基酸有三个蛋白( C、E1、E2 /NS1) 羧基端有4个蛋白( NS2、NS3、NS4、NS5)
HCV分子分型方法
陈长荣
ID:21620101152367
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丙肝病毒HCV
1975年, 英国Lancet杂志首次使用非甲非 乙型肝炎这个名词
1989 年, HCV cDNA 克隆成功, 并正式命 名HCV
1991年国际病毒命名委员会( ICTV ) 将 HCV 归为病毒科丙型肝炎病毒属
异性引物PCR法
Okamoto等首先采用 分型的效果仍比较差 需使用7对引物
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Okamoto H et al. J Gen Virol. (1992) Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and tracing infectious sourc1e1s.
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HCV genotypes in Northern Italy: a survey of
1368 histologically proven chronic hepatitis C
patients
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( 4)限制性片段长度多态性分析 ( RFLP)法:
用能识别特定酶切位点的限制性内切酶将 PCR 扩增的片段切割成不同长度的片段