英文论文翻译有无藻红蛋白的微囊藻株的16srDNA序列与系统发育分析Shigeto Otsuka ，Shoichiro Suda , Renhui Li , MasayukiWatanabe , Hiroshi Oyaizu , Satoshi Matsumoto , Makoto M. Watanabe摘要通过测定16S rDNA序列（16S rRNA基因），对含有五个变种和两种藻胆色素的15株微囊藻进行了系统发育分析。
所有的序列显示出了较高的相似性，不同形态与类型的藻胆素之间，有些甚至100%的相似。
从中可以推导出系统进化树与有无藻红蛋白的微囊藻株之间的密切关系。
数据显示微囊藻的表型不一定反映其发展史，因此需要重新构建当前物种级别间的分类。
关键字: 蓝藻；微囊藻；16S rDNA ；分类1.介绍微囊藻属是一种有毒且能形成水华的蓝藻。
根据伯杰氏细菌鉴定手册（第九版）[ 1 ]可知，微囊藻的特点是具有气泡，细胞形状呈球形，倾向于形成聚集体或群体，有不定形的粘液或者胶被，无藻红蛋白等等。
大部分物种是满足这些标准的，近年来[2 ]在日本海域区分了六个物种：绿色微囊藻(A. Brown), 惠氏微囊藻(Komaèrek), 铜绿微囊藻(Kuëtzing), M.挪氏微囊藻(Komaèrek), 鱼害微囊藻和水华微囊藻(Wittrock) .Komaèrek并没有将鱼害微囊藻和水化微囊藻区分开[ 3 ]。
“形态”一词用于对微囊藻种类进行分类，它包括细胞的大小，菌落的形态，和胶被的特性。
尽管形态分类的正确性总是受到质疑，但目前却没人能解答。
最近对四株以藻红蛋白为藻胆素的铜绿微囊藻进行了分离。
虽然藻红蛋白的占有率不符合上面所提到的标准的[1]，但除却藻胆素的成分不同之外，这些生物有着相同的作为微囊藻的分类特征。
据观察这些菌株的菌落形态与铜绿微囊藻所具有的形态是相同的。
然而，这些菌株是否应该根据形态特征归类为铜绿微囊藻或者根据藻胆素成分不同而被归类为新物种却还不能确定。
应用分子遗传学分析已成为蓝藻分类的一种重要方法。
以16S rDNA为基础的系统进化分析法是在细菌的分类中广泛使用的一种工具，该方法的优越性也已被证实[5]。
Neilan [6]等人用这个方法来探讨微囊藻的种间关系。
然而，在微囊藻属中他们没有找到任何系统发育与形态特征之间的相关性，而且有、无藻红蛋白的菌株之间的亲缘关系也没有检查。
在本文中，我们探讨了微囊藻株的16SrDNA序列和微囊藻形态的系统发育分析，然后讨论是否藻胆素成分和形态特征的不同会影响系统发育。
2.材料与方法2.1.蓝藻文化菌株的研究如下：微囊藻4A3, 4B3, T1-4, 和T17-1;绿色微囊藻TAC17 和TAC78;铜绿微囊藻TAC71, TAC86, 和 TAC170;挪氏微囊藻TAC20 and TAC65;和鱼害微囊藻TAC48 和 TAC91.在我们以前的研究中四株微囊藻全部是被隔离的[4]并均含有藻红蛋白，而其他不含有藻红蛋白的则来自日本筑波国立科学博物馆的藻类收藏。
该菌株的来源：中国（微囊藻4A3和4B3），泰国（微囊藻t1-4和t17-1）和日本（其他菌株）。
这些菌株中除了4B3和T17-1均是无菌的。
将该菌株培养在MA[7] 培养基中，温度为25 ±1 ℃，周期是12:12 L/D ，同时用光子通量密度为30 µmol mˉ¹ sˉ¹的日光灯的进行照射。
2.2.引物设计以蓝藻的16S rDNA序列为基础，重新设计了扩增和测序的引物，但不包括被Neilan[8]重新修复的引物23SR.两对扩增的引物，msr-s1f和msr-s2r序列，在基因数据库中进行比对[9]的时候显示出高特异性。
无菌株的扩增引物是msr1f 和23sr，而非无菌株的扩增引物是两对msr1f和msr-s2r，和msrs1f和23sr。
所有的引物都是由由日本粉米尔斯有限公司商业合成。
（神奈川，日本）。
2.3.聚合酶链反应扩增和测序依据palinska等人提取的DNA聚合酶链反应（ PCR）的模板[ 10 ]，从被提取的DNA中扩增16S rDNA序列。
Pcr进行的条件是，50- or 100- µl 的反应混合物，0.05µl 的耐热扩增DNA聚合酶(Perkin Elmer, Branchburg, NJ,USA)，Perkin Elmer提供的缓冲液，0.2mM的dNTPs，0.5 uM的引物，0.01 ^ 0.05µlˉ¹的基因组DNA溶液（100 ^ 500 ng µlˉ¹），1.5mM处理过的氯化镁。
该反应在一个接地的热循环仪（Hybaid, Teddington,Middlesex, UK）中运行，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，50℃退火30s，72 ℃延伸1分钟 s，循环30次，最后72 ℃延伸3分钟。
使用microspin1 S-400 HR柱 (Pharmacia Biotech,Uppsala, Sweden)纯化扩增产物，用已被荧光标记引物的热循环测序试剂盒进行循环测序。
(Amersham Life Science, Buckinghamshire,UK)。
该反应产物使用4%的试剂盒在dsq-1000l DNA测序仪（岛津，东京，日本）上测序。
2.4 比对和系统发育分析and phylogenetic analy用Clustal W 1.6[11]版比对序列数据，然后将其转换为距离矩阵，再用邻位相连算法将距离矩阵构建为系统树。
然后在改正多个替换位置并排除空隙位置之后，将随机数生成的种子数和引导实验的种子数分别设置成111和1000。
另外将有空隙的位置排除后后，设定相同种子数使用2.3b3版本[12]的 MOLPHY程序按照最大似然法进行了分析。
使用NucML计算最大似然距离矩阵，用MOLPHY package.的 NJdist构建最初的邻位相连树。
根据HKY模型的R选项使用nucml建立最大似然树，根据重采样估计的自然对数方法估计局部的引导概率。
[13]Fig. 1. Maximum likelihood tree of the Microcystis strains and related organisms. An alignment of 1328 nucleotides after excluding positions with gaps was used. Scale bar=1 base substitution per 10 nucleotide positions. Local bootstrap probabilities (for branches except those within the Microcystis cluster) are indicatedat nodes. Microcystis [I] represents Microcystis sp. 4A3 and 4B3, and Microcystis [II] represents M. viridis TAC17 and TAC78, M. wesenbergii TAC38, M. aeruginosa TAC71. `Outgroup' represents Chromatium tepidum and Escherichia coli. Accession numbers in the DDBJ, EMBL, and GenBank databases are Microcystis sp. 4A3, AB012326; 4B3, AB012327; T1-4, AB012329; T17-1, AB012330; M. viridis TAC17, AB012328; TAC78, AB012331; M. wesenbergii TAC38, AB012334; TAC52, AB012335; M. aeruginosa TAC71, AB012332; TAC86，AB012333; TAC170, AB012340; M. novacekii TAC20, AB012336; TAC65, AB012337; M. ichthyoblabe TAC48, AB012338; TAC91, AB012339; Mr. glauca B1448-1, X94705; Synechocystis sp. PCC6803, D90916; G. membranacea PCC6501, X78680; Microcoleus sp. PCC7420, X70770; T. tenue, AF013029; O. agardhii CYA18, X84811; A. nidulans PCC6301, X03538; Synechococcus sp. PCC7942, D88288; S. elongatus,D83715; C. tepidum M59150; and E. coli, E05133.3.结果与讨论根据 Watanabe [3]的结果本文认为水华微囊藻是鱼害微囊藻的一种。
目前微囊藻属包括五种形态种，因此包含了大部分随处可见的在微囊藻中占主导地位的蓝藻。
对无菌和非无菌的菌株进行PCR扩增产物测序。
设计的引物能够帮我们将两条重叠的16SrDNA 序列进行排序。
所有的微囊藻株在本研究中被证明具有相同的16S rDNA序列长度，即1457bp，对应于大肠杆菌的16S rDNA 33-1542位置。
绿色微囊藻TAC17 和 TAC78，惠氏微囊藻TAC38，铜绿微囊藻TAC71，以及微囊藻属4A3 和4B3均显示百分百的相似性。
在这些菌株中，所有菌株的DNA序列均显示出超过99%的较高相似性（表2）。
除却与铜绿微囊藻TAC86有99.5%的相似性之外，微囊藻T17-1与其他微囊藻有99.7%甚至更高的相似性。
铜绿微囊藻TAC86与鱼害微囊藻TAC48有99.8%的相似性，与微囊藻T17-1有99.7%的相似性。
这些结果表明，目前对现有的菌株，包括五个变种菌株和四株含有藻红蛋白的菌株还不能做出明确的分工。
这些菌株是否属于同一物种可以通过DNA-DNA杂交相结合的百分比鉴定。
在一个物种中% RB的值应大于70%。
Fox[15]等人通过利用芽孢杆菌证明如果16S rDNA的同源性是99%或更多，DNA-DNA杂交可能或也不可会记录此物种的存在。