"
引
言
特性清楚且稳定，具有足够的安全性，应选用适当 的分子生物学方法如 X41 序列分析、杂交等确定宿 主菌的遗传组成。 有了食品级基因修饰菌的明确定义，美国、荷 兰、丹麦等国的研究人员作了大量有关用基因工程 技术改良乳制品发酵剂的研究，而这个领域的研究 在国内仍属于空白。本文的目的就在于将当前国际 上利用基因工程技术修饰、改造传统乳制品发酵剂 的研究状况作一总结，以促进国内食品生物技术的 发展。 乳制品发酵剂依产品主要可分为奶酪发酵剂、 酸奶发酵剂、奶油发酵剂三大类。无论是哪种发酵 剂，人们最关注的性能有以下几个方面：产生双乙 酰的能力；蛋白水解能力；产生胞外多糖的能力； 抗病原菌、杂菌污染能力；抗噬菌体侵染能力。本 文将从这几个方面入手，阐述用基因技术改良乳制 品发酵剂的思路及研究成果。
根据此原理 ，假若使菌 株丧失合 成 ! 1 乙酰乳 酸 脱 羧 酶 , ! 1 .45-"#.4-.-5 654.78"9:#.;， <=>） 的 能 力， ! 1 乙酰乳酸会积累，菌株产生双乙酰的能力就 会提高。事实上，目前工业上广泛应用的产双乙酰 能力强的 !" #$%&’( )’*+$," -’$%.&/#$%&’( 菌株就是 ! 1 乙 酰乳酸脱羧酶缺陷型菌株，但是它对噬菌体较敏 感，一旦噬菌体浸染发生，没有菌株可以替换它。 这才促使人们利用基因工程技术去获得 <=> 缺陷型 菌株。 &??/ 年 @"ABC# 报道了用基因工程技术筛选 <=> 缺陷型菌株的方法 2 % 3 。该方法的理论基础是 ! 1 乙酰 乳酸是 % 1 羟基 1 * 1 丁酮的前体，也是亮氨酸缬氨 酸合成的前体物质；当培养基中存在亮氨酸时，会 发生产物抑制效应，即 <=> 被激活使 ! 1 乙酰乳酸 发生脱羧反应，生成 % 1 羟基 1 * 1 丁酮；反之，不 存在亮氨酸时， <=> 没有活性， ! 1 乙酰乳酸不能发 生脱羧反应而转向亮氨酸缬氨酸的生物合成。因此 当培养基中有亮氨酸而无缬氨酸时，菌体细胞会因 缬氨酸缺乏而无法生长。但是 <=> 缺陷型菌株在有 亮氨酸而无缬氨酸基质中培养时， ! 1 乙酰乳酸不会 转变成 % 1 羟基 1 * 1 丁酮，菌体将正常进行亮氨酸 缬氨酸的生物合成，进行各种生命活动。 应用此原理筛选 <=> 缺陷型菌株需有一前提， 即菌株要有合成缬氨酸的能力。但是遗憾的是，自 然存在的乳酸菌菌株绝大多数已经丧失了这种能 力。为此， @A7C4 将携带有缬氨酸合成酶基因的质粒 载体 BD@++E 电穿孔法转化到宿主双乙酰乳酸乳球菌 中，使其获得合成缬氨酸的能% &%#’( #$&)*+’(
基因工程改良乳酸菌发酵剂品质的研究进展
畅天狮，刘俊果，张 桂
) 河北科技大学 生物工程学院，河北 石家庄 "%""$- + 摘 要：综述了近 % 年来利用基因工程技术改良乳酸菌发酵剂蛋白质水解能力、产生双乙酰能力、合成胞外多糖能
力、抗杂菌病源菌污染能力 ’ 个方面研究的最新进展，并简要介绍了基因食品可能存在的不安全问题及解决方法。 关键词：基因工程；乳酸菌发酵剂 中图分类号： ./!%!0 %’ 文献标识码： 1 （!""# ） 文章编号： $""$ ( !!#" "% ( ""#’ ( "’
基因工程技术的广泛应用，使生命科学的研究 发生了历史性的变化，同时也产生了巨大的社会和 经济效益。利用基因工程技术改造传统的发酵食品 用微生物是当前食品生物技术领域的一个新的研究 热点。 很多发酵食品中含有未灭活的发酵剂微生物， 并随食品进入人体，因此在利用基因重组技术改造 食品用微生物时，首先应保证具有足够的安全性。 食 品 级 基 因 修 饰 菌 ) AE8ED6H7NNM SBI6F6EI S6HJBBJ9 A786:S: + 是指被导入源于同种或公认的安全的食品级 微生物的基因，并因此而具有某种优良性状的用于 发酵食品生产的微生物 列要求
*
图& 乳酸菌乳糖分解代谢示意图 2 * 3
蛋白水解能力
蛋白水解能力是衡量干酪发酵剂的重要指标。
发酵剂在干酪的成熟过程中，水解乳蛋白，产生小 分子肽和氨基酸，是成熟干酪的重要风味成分。 乳酸菌的蛋白水解系统包括 2 ) 3 ：结合在细胞壁上 的蛋白酶 I7-I，其功能是将细胞外的蛋白质水解成 寡 聚 多 肽 ； 细 胞 膜 上 的 寡 聚 肽 转 运 子 PII （ "#CQ"B5B-C65 -7.L;B"7-57），其功能是将寡聚多肽由 细胞外转运到细胞内，该步骤是乳酸乳球菌在牛乳 中生长的关键步骤， PII 缺陷型的突变株不能在以 酪蛋白为唯一氮源的培养基上生长。细胞内蛋白 酶 ， 如 氨 基 肽 酶 B5B(、 二 肽 酶 B5B!、 内 肽 酶 B5R BP、胱氨酸肽酶 B5B@ 等，将寡聚多肽最终水解为氨 基酸。 依据上述理论，国外科学工作者作了一些改良 发 酵 剂 蛋 白 水 解 能 力 的 尝 试 。 S5L7CT;5L 等 人 2 & 3 将 B5B(， B5B!， B5B5@， B5BP 蛋 白 酶 基 因 分 别 克 隆 到 BUV& 质粒中，并分别在 =$ #.4-C; DV&%/% 中表达，制 作成 单一 菌株的 发酵 剂，进 行 )+ TQ 奶酪 的生 产实 验 。结 果 表明 ， 经 E N / 个 月 的成 熟 期后 ， 转 B5B( 和 B5B@ 基因的发酵剂作成的奶酪；同对照组相比， 苦味明 显降低，嗜 好性味增加 ；而转 B5BP 和 B5B! 基因的发酵剂同对照组没有明显差异。 由于乳酸菌的多数蛋白酶属于胞内酶，因而有 人认为在奶酪发酵成熟的过程中，菌体可能会发生 裂解，释放胞内酶，进而水解介质中的蛋白质。将 噬菌体溶菌酶基因 "!D=% 克隆到 BUV& 质粒中，并 在 DV&%/% 中表达 ，制作成相应的发酵剂 和奶酪， 结果乳酸菌在奶酪成熟后期的自溶能力显著增强， 苦味显著降低，嗜好性味显著增强 2 / 3 。
6 7，8 9
成一个 8( % 45 的多顺反操纵子， %J 端有一核糖体结 合位点，#J端有一个终止密码子和依赖 ! 因子的转录 终止子。 /-.-@ 的前体肽有 %7 个氨基酸组成，其中 / 端 !# 个残基为信号肽，它在细胞表面会被信号肽酶 水解去除，最终释放出成熟的有活性的 /-.-@ 6 $$ 9 。 基于上述的研究成果，国外研究者尝试用基因 工程技术增强奶酪发酵剂产生 /-.-@ 的能力，但结果 却不尽人意。产生 /-.-@ 的能力提高的同时，乳糖代 谢的速度下降，发酵剂的蛋白质水解能力及耐热性 也都下降。分析原因，认为奶酪的发酵剂是混合型 的，含 有多种乳酸 菌，产 /-.-@ 的 菌株对不产 /-.-@ 的菌株的生命活动有拮抗作用 6 $! 9 。 />K-* 6 $! 9 尝 试 将 片 球 菌 素 2BC-D+D+-@ 基 因 克 隆 并 在乳酸球菌中表达的试验。 ;BC-D+D+-@;EF$ 由乳酸片 球 菌 ;BC-D+D++>. *+-C )*+,-+- 产生 ， 该菌 乳糖 发 酵能 力弱，它主要是作为生物防腐剂控制食品中的杂菌 和 病 源 菌 。 ;BC-D+D+-@ ;EF$ 的 相 关 基 因 在 质 粒 上 ， 是一个含 1 个基因的操纵子。将该操纵子克隆并构 建成食品级表达载体 2=L$$7 质粒，转化到乳酸乳球 菌 ==!$1 中，得工程菌 ==!$7。以此菌制作成发酵 剂，并进行奶酪得生产试验。结果表明，试验组奶 酪在发酵 $ C 时含 &1 """ （EK5-,K*KM N@-,） 2BC-D+-@， & 个 月后降 到 ! """ ，而对 照组 没有检 测到 2BC-D+-@
V!W V$W
。其基因修饰过程应满足下
： ! 功能性基因必须源于同种菌或公认的安
全的食品级微生物； " 载体必须是食品级的，不得 含有非食品级的功能性 X41 片段； # 选择性标记不 得选用各种抗生素抗性标记，防止抗生素抗性基因 随菌体进入人体。应选用食品级的标记基因，如糖 类利用标记、营养缺陷型标记等； $ 宿主菌的遗传
#’
!""# 年第 #$ 卷第 % 期（总第 $%& 期）
专题论述
少量的丙酮酸在 ! 1 乙酰乳酸合成酶的作用下形成 不稳定的中间产物 ! 1 乙酰乳酸，极易受 ! 1 乙酰乳 酸脱羧酶作用形成 % 1 羟基 * 1 丁酮，并最终被缓慢 氧化成 * ， % 1 丁二醇 （见图 &）。一些乳酸菌突变 菌株具有很强的双乙酰产生能力，研究证实这些菌 株体内没有 ! 1 乙酰乳酸脱羧酶。据此可以认为，在 没有 ! 1 乙酰乳酸脱羧酶存在时， ! 1 乙酰乳酸会积 累，在有氧气存在时经化学氧化过程转变成为双乙 酰 2 * 3 。这也是双乙酰产生的机理。 能够合成缬氨酸的阳性转化子（ >F+E&+ H ID@++E， !.# G ） # <=> 缺陷型筛选 # >F+E&+ H ID@++E， !.# G <=> 1 #去除质粒 BD@++E # D@+&+。 最后获得的菌株 D@+&+ 不含有任何外源 >(<， J"A-K57L 杂交和 >(< 印记反应证明其基因图谱同野 生的 =$ #.4-C; 6C.45-:#.4-C; >F+E&+ 是一样的，因此具 有足够的安全性，是一食品级基因修饰菌。用该菌 进行强化柠檬酸的 D&M 培养基发酵实验，产酸速度 和产酸总量和对照组没有明显差异，而 ! 1 乙酰乳 酸的产量提高 &+ N E+ 倍，双乙酰的产量增加 &+ 倍 以 上 。 用 D@+&+ 试 制 发 酵 奶 油 ， 产 品 在 储 藏 & 6 后，双乙酰的浓度高达 +$ ** OO"# H =，而对照组仅 为 +$ +& OO"# H =，储藏 & 周后，双乙酰的浓度降为 +$ +E OO"# H =，对照组仍为 +$ +& OO"# H =。