沉淀反应
基本概念
• 沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体在适当条件下反应生成沉 淀物 • 特点 – 反应物可溶（溶液） – 生成物为沉淀（抗原抗体均为多价，相互结合，形成空 间网格，体积变大而从溶液中析出） – 抗原抗体的比例对试验现象的影响明显 • 类型
液相沉淀试验
反应场所 检测方法
凝胶扩散试验 凝胶免疫电泳试验
• 免疫浊度测定 – 一定比例的抗原抗体反应可生成肉眼不可见的、一定大 小的复合物 – 光束通过该溶液时，免疫复合物对光会产生作用（吸收、 折射），作用的大小与复合物的多少呈正相关 – 根据测量手段和方法的不同可分为：透射比浊法、终点 散射比浊法和速率散射比浊法
透射比浊法
• 原理 – 在固定且过量的抗体中加入待测的抗原，经过一段时间 反应后生成复合物，复合物的量与待测抗原含量成正比 – 当光束通过该溶液时，被复合物吸收、反射，导致透射 光的减少，减少的程度与复合物的量成正比 – 以已知抗原的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标， 建立标准曲线，通过测定待测抗原反应后溶液的吸光度 大小，在曲线上测出待测抗原的浓度 • 方法评价 – 灵敏度较高、重复性较好、操作简便、对仪器要求不高 – 反应时间长、参加反应的抗原抗体比例要保证抗体过剩 且不能极度过剩
Байду номын сангаас
待测抗原的浓度与沉 淀峰的高度成正比
1 2 3 4 5
＿
方法评价
操作简单、重复性好，灵敏度高
对流免疫电泳
原理
电场中 的双扩
_
Ag Ab
+
在电场的作用下，抗原抗体相向运动 在比例合适处，形成肉眼可见的沉淀线 方法评价 将双扩的自由扩散变为定向运动，使反应快速、灵敏度提高
终点散射比浊法
• 原理 – 为改良的透射比浊法（测定散射光强度） • 方法评价 – 方法灵敏、可自动化 – 反应时间适当、影响因素较多、需特殊仪器
速率散射比浊法
• 原理 – 在过量的抗体中加入待测的抗原，两者反应生成免疫复合 物，在反应达终点之前，复合物数量递增 – 在不同的时间点上，复合物增加的量（速率）是不同的， 而最大速率（峰值）只有一个时间点 – 在反应的过程中，峰值出现的时间点很快出现并能被特殊 的仪器捕捉、测出 – 峰值的大小与待测抗原的含量成正比 • 方法评价 – 测量快速、灵敏、精密度高、稳定性好 – 需特殊仪器
单向琼脂扩散试验
• 原理
待测抗原在含在一定量的抗体中自由扩散 在抗原抗体比例合适处形成大分子的抗原抗体复合物而 被限制在网孔中，形成肉眼可见的沉淀环 待测抗原与沉淀环的直径成正比
方法评价
定量检测物质、方法稳定、简便、无需特殊仪器 灵敏度稍差
Ab
双向琼脂扩散试验
• 原理 – 抗原抗体在凝胶中自由扩散，发生相遇 – 在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线 • 类型 – 成对孔、三角形孔、梅花形孔
液相内沉淀试验
• 环状沉淀试验 – 原理 将抗原液叠加在已知的抗体溶液上面，在两液的 交界面抗原抗体发生反应生成白色沉淀环 –方法评价 简便快速、但只能定性且 灵敏度低，少用
抗原 沉淀环 抗体
• 絮状沉淀试验 – 原理 抗原溶液与抗体溶液混合，在电解质存在的条件 下，两者结合出现肉眼可见的絮状沉淀 – 方法评价 方法简单，不需特殊设备，灵敏度低，受抗 原抗体比例影响明显，少用；可用于确定对应抗原抗体 反应的最适比
梅花形孔
1:2 1:4
Ag
1:64
1:8 1:32 1:16
中间孔为Ag、周边孔为倍比稀释Ab
出现沉淀线孔的Ab最高稀释度为待测抗体的效价
免疫电泳技术
• 带电颗粒在电场中的运动 – 抗原抗体在凝胶中为带电颗粒 – 在电场的作用下向相反电极运动为电泳 – 某些凝胶（琼脂）固体骨架上基团为阴离子，感应其附 近的水分子带上正电荷，这种水分子在电场的作用下运 动方向为正极到负极，同时推动颗粒的运动为电渗 – 颗粒的运动为电泳和电渗的合运动 • 类型 – 免疫电泳、火箭免疫电泳、对流免疫电泳
成对孔
Ag
Ab A B C D E F
应用
定性：沉淀线的有无
相对浓度：沉淀线的位置（靠近浓度小的一侧） 相对扩散率：沉淀线的形状（弯向扩散慢的一侧）
三角形孔
Ab Ag1 Ab Ag1 Ab
Ag1
Ag2
Ag2
Ag2
沉淀线吻合：两种 抗原完全相同
沉淀线相交：两种 抗原完全不同
沉淀线相切：两种抗 原之间部分相同
免疫电泳
原理
－
＋
电泳：分离复杂组分（不同的蛋白质的PI、分子量不同， 在电场中的运动速度不同，相同时间在凝胶中的停留位置不同） 双扩：在与电泳平行方向挖槽，加混和抗体，与分离开的组分自 由扩散，在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线 应用：用于复杂抗原的成分分析
火箭免疫电泳
原理
＋
电场中的单扩
Ab
在电场的作用下，抗原 在含一定量抗体的凝胶 中扩散 形成肉眼可见的沉淀峰
凝胶的制备
• 原料 – 固体粉末（琼脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺） – 电解质液 • 过程 按要求把一定比例（1%）的固体粉末与电解质液混 合，加热助溶，冷却，形成具有三维空间网孔的半固体结构 • 性质 – 实为流动的液相 – 网孔的大小与凝胶的浓度成反比 – 小分子的颗粒在凝胶中自由运动，动力来源于物质的浓 度差，而大分子物质的运动则受到网孔的限制