定向进化与自然进化的异同 点
定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸 和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化， 使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同：
•进化动力不同： 保守突变 非保守取代；
•进化方向不同： 适应突变的积累；
•进化速度不同： 非常漫长
•
只需几年、甚至几天； 超越生物学意义的要
定向进化的应用
目标酶
卡那霉素核苷基 转移酶 枯草杆菌蛋白酶
所需功能
热稳定性 作用于有机溶 剂 作用于新底物 有机溶剂中的 底物特异性和 活性
方法
定位诱变+选择 易错PCR+选择
结果
在60-50℃酶半衰期 增加200倍 在60％二甲基亚砜主 仆女冠活力增强170 倍 对cefotaxime的抗性 增加32000倍 活力增加60-150倍
• 优点：简便，随机的定向进化
DNA 重组技术(DNA Shuffling)
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
• DNA改组具有以下有用的特征： • ①它可以利用现存的有力突变，快速积累不同的 有利突变； • ②重组可伴随点突变同时发生； • ③可以删除个体中的有害突变和中性突变。 • 缺点：DNA改组过程中伴随的较高待点突变频率 会严重阻碍正突变组合的发现。由于绝大多数突 变是有害的，有利突变的重组和稀少有利点突变 会被有害突变的负背景所掩盖。
生物多样性：整个生态系统中的生物
什么是定向进化技术
• 概念提出： • 1993年，美国科学家Arnold F H首先提出 酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶 的改造或构建新的非天然酶。
• 酶分子改造：
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化
• 模拟自然进化的过程，进行人工随机突变， 并在特定的环境条件下进行选择，使进化 朝着人们所需方向发展的技术过程。
交换催化反应的专一性
• 来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物p-硝 基-苯基-2-甲基葵酸盐的S构型的选择性2%。 • 经过4轮易错PCR突变和筛选后，它对底物 的S型的选择性达到81%
Fig. 1. Publication rate of the ‘directed evolution’ articles in biomedical literature between 1995 and 2004. The analysis was achieved using the National Institutes of Health MEDLINE bibliographic database. The figure shows the total number of articles published each year, which contain the key words ‘directed evolution’ in their titles.
丝 状 噬 菌 体 的 生 活 周 期
噬菌体显示筛选模式
噬菌体显示的几种类型
M13噬菌体pIII和pVIII的显示
酵母双杂交展示
• 典型的真核生物转录因子（如GAL4）含有两个不同结构域: DNA结 合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcriptionactivating domain)。 • 前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节 的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。 • 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而 且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
• 对酶分子的研究可以分为认识和改造两个 方面，前者是利用各种生物化学，晶体学 光谱学等方法对天然酶或其突变进行研究， 获得酶分子特征，空间结构和功能之间的 关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造，成为酶分 子的合理设计。如化学修饰，定点突变等。
澄清一个事实：定向进化不是定点突变 • 定向进化：突变 筛选
• 将对卡那霉素有抗性的卡那霉素核苷酸转 移酶基因转化进大肠杆菌，获得基因的突 变库 • 将突变库转入可以在高温下生长的耐热菌， 即嗜热脂肪芽孢杆菌中
• 通过在高温下进行筛选获得了一个在63℃ 下稳定的突变酶(Asp80Try)和一个在70℃ 稳定的突变酶(Asp80Try，Thr130Lys)
2.基本原理
提高底物的专一性
• Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶，对于 癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了9倍 • Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱 苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功
对映体选择性的定向进化
• S型选择性的转氨酶转化ß-丁酮，仅有65% 的手性专一性。 • 通过10 000个随机突变的菌株的筛选，获 得10个手性专一性在80%-94%之间的酶
3. 定向进化的基本过程
• 随机突变• 构建突变基因 • 定向筛选3.1 随机突变
• 易错PCR技术
• DNA 重排技术(DNA Shuffling) • 基因家族重排技术
易错PCR技术
降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ 提高Mg2+浓度
• DNA shuffling技术的改进
• 交错延伸技术 • 随机引物体外重组技术
交错延伸技术
在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一 步, 缩短其反应时间，从而只能合成出 非常短的新生链，经变性的新生链再作 为引物与体系内同时存在的不同模板退 火而继续延伸。此过程反复进行，直到 产生完整的基因长度。
——诺贝尔奖获得者
M. Eigen
内容简介
• 酶定向进化简介：基本原理、研究历史 • 定向进化的策略：、现状和未来
1.研究历史
• 第一次在分子水平上定向改造单一分子的是 Sol Spiegelman 在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q 进行的一个实验，当时他的目的是为了证明达尔 文的自然选择也可以发生在非细胞体。此实验并 没有实际的应用价值 • 1981年，B.G.Hall等报道了他们定向改变大 肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性， 开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。 • 1986年R。Hageman等进行了开发有效提高 常温生物中酶分子热稳定性的实验。
• 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋 白的相互作用。 • 主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNAactivating domain的载体。
4. 酶定向进化的应用
• • • • • 提高酶催化效率 改变底物特异性 改善酶的稳定性 获取具有新功能的酶 提高药用蛋白和疫苗的活性
• 利用基因工程原理在实验室中模拟生物进 化过程
– 化学进化 – 生物进化
• 生物的自然进化
进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
进化结果：
基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个基因或同一个基因(同源基因，或同工酶) 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径（木糖——木酮糖）
代谢产物的多样性因的任何一种可能 的突变信息 • 完整性：尽可能完整反映基因的结构和功 能信息，以便筛选得到具完整功能的进化 酶
• 表达载体： • λ噬菌体载体系统：最早使用。适合大片段的克隆； 转染率高，可达106以上；质量控制较好；适合长 期保存。 • 质粒载体系统：体外操作简便，段再群体扩增时易丢 失；转化效率较低；不能长期保存。
最适生长温度提高了！
诱发突变的 因素
细菌
50 C培养
0
最适生长温度为 37 C
0
突变体库
选择压力 （温度）
温度耐受型突 变体
– 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解 酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的 进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基 因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并 定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
• 组装
3.2 突变库的筛选
• 1.定向选择环境条件的设定
• 逐步改变调整所设定的环境条件
• 2.高通量筛选
• • • • • 平板筛选 荧光筛选 噬菌体表面展示 酵母表面展示 核糖体展示
平板筛选
依据重组细胞的表型，包括细胞生长状态、颜色变 化情况、透明圈情况等进行筛选。
使抗生素失效的酶类(如头孢菌素酶，b -乳糖酶） 提高耐热性 易于观察的菌落表型（如菌落颜色等） 营养缺陷型的辅助筛选
第八章 酶的定向进化
• 利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转 化，已广泛应用于各个领域：医药方面、 食品工业方面、轻工、化工方面、能源开 发方面、环境保护方面等等
• 天然酶的局限：
• 酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶 学研究和工业化应用的要求 • 而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低 • 还缺乏有商业价值的催化功能，尤其是对一些非 天然底物具有惰性 • 在非水环境下的低活力 • 对辅酶的依赖等
突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
• 定点突变：
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
现代生物工程的要求
能具备长期稳定性和活性
能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的 合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物 或药物的原材料
•如何利用相对简单的方法以达 到对天然酶的改造或构建新的 非天然酶就显得非常有研究意 义和应用前景