(Avian myeloblastosis virus)
principle & method in PCR
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❖典型的PCR反应体系：
TaKaRa Taq（5 U/µl） 0.25 µl
10×PCR Buffer（Mg2+ Plus） 5 µl
dNTP Mixture（各2.5 mM） 4 µl
模板DNA（λDNA）
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RT-PCR
❖ RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩 增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA合成cDNA，再以 cDNA 为模板，扩增目的片断。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基 因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定 基因的cDNA序列。
❖ 加入适量DEPC处理水，55-60℃水浴10min溶解总RNA，测OD值。
建议立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃。
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❖ DNA、RNA提取试剂盒
❖ 自动核酸提取系统
生物梅里埃公司NucliSENS® easyMAG™系统 FastPrep®(FP220A)快速核酸提取仪 美国应用生物系统公司 6100型核酸提取仪 富士QuickGene 610L型自动核酸提取系统
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模板 是指包含待扩增片段（目的片段） 的一段DNA，可以是细菌和病毒的基因组 DNA，细菌质粒DNA，也可以是病毒RNA 经体外逆转录后形成的cDNA。
引物 是指与目的片段两翼互补的一对单 链DNA片段，一般由17-30个寡核苷酸组 成。
DNA聚合酶 耐热。商品化名称为Taq 酶
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延 伸(elongation):反应温度再次升高， 在DNA 聚合酶的作用下、 Mg2+存在的条 件下，4种dNTP从引物的3’端开始参入， 引物沿5’-3’方向延伸，合成出新生的 DNA互补链。
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❖注意事项
1.防止DNA酶的污染 试剂、样品的存放 DNA模板制备 操作过程中移液器、离心机等的使用 PCR反应各组分的混合
2. 避免试剂、样品、模板等多次冻融 3. 设立阳性对照和阴性对照
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❖ PCR条件对反应的影响
1.模板质量 2.引物设计、浓度 3. Mg2+ 4.dNTPs 5.退火温度 7.延伸时间 8.循环次数
❖ 加入200ul的氯仿，用力震荡（溶液充分乳化），室温放置10min 。
❖ 离心（ 4℃、13000r/min、15min），取上层液相移入另一管。
❖ 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。
❖ 离心 （4℃、13000r/min、15min），用枪小心吸去上清。
❖ 1ml75%乙醇，离心（ 4℃、8000r/min、10min），吸去上清，干燥 5min。
DNA 的提取和纯化
❖ 细菌裂解获得DNA，裂解可以采用多种方法， 这些方法包括用去污剂、有机溶剂或碱进行 处理及用加热处理等。 DNA 的提取和纯化试剂盒。
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RNA的提取和纯化
RNA提取的五个关键点：
❖ 样品细胞或组织的有效破碎； ❖ 有效地使核蛋白复合体变性； ❖ 对内源RNA酶的有效抑制； ❖ 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； ❖ 有效除去多糖含量高的样品中的多糖杂质； ❖ 抑制ＲＮＡ酶活性。
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M-MLV（Moloney Murine Leukemia Virus）
具有以下几种活性：
❖ 依赖于RNA的DNA聚合酶活性； ❖ 依赖于DNA的DNA聚合酶活性； ❖ RNase H活性(催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA ) 。
AMV转录酶（鸟类成髓细胞白血病菌病菌毒）
PCR技术的基本原理和方法 Principle and Method for PCR
一、PCR 技术的基本原理
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❖ PCR — 聚合酶链式反应
优点：方法操作简单，反应快速敏捷，结果可靠 原理：与细胞内发生的DNA复制过程十分相似。
是在模板、引物和4种dNTP（包含A、T、C、G四种 碱基的脱氧核苷酸）存在条件下，依赖于DNA聚合酶 体外扩增目的DNA的反应。
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二、PCR反应基本方法
principle & method in 分子生物学实验的基础， 对于其下游工作是非常重要的。高质量 的核酸是PCR、实时PCR等实验的基础。 因此选择好的提取方法和试剂是非常重 要。
2.5 ng
引物 1（20 M）
1l
引物 2（20 M）
1l
灭菌蒸馏水
up to 50 l
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❖常用PCR循环条件：
95 ℃ 5min 95 ℃ 30sec 55 ℃ 30sec 72 ℃ 30sec 72 ℃ 10min
30-35个循环
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❖PCR反应的3个步骤
变 性(denaturation): 通过加热使DNA双 链解开，成为单链DNA的过程
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退 火(annealing):反应混合液冷却至 某一合适的温度，两个引物分别与两条 单链模板的互补区域结合的过程
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Trizol法提取RNA的实验流程
提取物：血清、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液等液体中的病毒。提取时尽量
在人少时进行，防止空气中RNA酶的污染。所用一切物品也应是无RNA酶的。
❖ 提取物原液500ul，TRIzol （Gibco公司） 500ul，充分混匀，室温放置 10min。