郑州瑞泽欣生物技术有限公司
正文
1 操作前的准备工作
1.1 分别检查无菌操作室、菌种室、培养室、镜检室、准备室是否已清洁，且不存在与本批生产无关的记录或残留物。

1.2 是否有本批的菌种制备岗位空白生产记录，状态标识、周转容器等是否足够、齐全，生产区的设备和容器是否已标示好。

如培养箱、超净工作台、显微镜、冰箱等。

1.3 检查空调和空气净化系统是否检测，是否清洁并且在合格期限内。

1.4 检查待用的物品是否准备到位，是否已灭菌并在合格的有效期之内。

如菌种（菌落或芽孢悬液）、无菌PB溶液、工作服装、纯化水、接种针、移液枪及其配套枪头、酒精灯、染色剂（孔雀绿溶液、沙黄溶液）、擦镜纸、香柏油、载玻片、计数板、盖玻片等。

1.5 有没有上批产品的清场合格证副本。

1.6 检查操作间的温度、相对湿度等环境卫生条件是否符合工艺规定的要求。

2 镜检操作
2.1 玻片染色法
2.1.1 PB溶液配制：按规定的标准操作要求配制，浓度0.2M，pH值7.2。

2.1.2 孔雀绿溶液配制：按规定的标准操作要求配制，浓度7.6%。

2.1.3 沙黄溶液配制：按规定的标准操作要求配制，浓度0.5%。

2.1.4 制标本片
芽孢菌落标本制作时，按无菌操作，先将洁净载玻片用酒精灼烧杀菌，标识出明显标本区域，在区域内滴一小滴PB溶液，用接种环刮取2--3个菌落，在滴的PB溶液内均匀涂成薄膜，晾干固定，如有必要时刻将涂片通过火焰3次温热固定，但不可使温度过高，将菌烧死或烧变形。

晾干后，滴孔雀绿溶液与菌膜上，要全部覆盖涂的菌膜区，染色15--20分钟，水洗脱色，直至流出的水无绿色为止，淋去表面水，晾干后，复染，滴上沙黄溶液，染色2--3分钟，倾去染液稍微用水冲去染液并用滤纸吸干残液，晾干。

标注清楚标本的品名、批号、编号、培养时间、日期等。

即制成芽孢菌落标本。

2.1.5 干燥后用油镜观察，芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。

2.1.6 观察至少3个视野，计数每个视野中的芽孢数和杆菌数，记录并计算出芽孢数平均值（A）和杆菌数平均值（B）。

2.1.7 计算镜检芽孢率：按下式计算镜检芽孢率：N=A/(A+B)×100%。

式中：N:代表样品的镜检芽孢率；
A：代表样品的镜检视野中芽孢数的平均值；
B：代表样品的镜检视野中杆菌输的平均值。

2.1.8 嗜热脂肪地芽孢杆菌的镜检芽孢率达到95%以上时，方可用于制备生产用芽孢悬液。

2.2 血球计数板法
2.2.1 标本制备
2.2.2.1 镜检计数室:
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。

若有污物，则需清洗，自然晾干才能进行计数。

2.2.2.2 加样品:
将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的芽孢悬液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。

多余培养液可用滤纸吸去；
2.2.2.3 计数。

稍待片刻（约5min），待菌体全部沉降到计数室底部后，将计数板放在载物台的中央，先在低倍镜下找到计数室所在位置后，再转换高倍镜观察、计数并记录。

2.2.2.4 计算
将所记得的数量带入下公式计算，得镜检的芽孢悬液的浓度：
每毫升原液中芽孢个数／1mL＝每个小方格中芽孢平均数×4×106×稀释倍数
2.3 检定结果标准：镜检芽孢率达到95%以上时，方可用于制备生产用芽孢悬液。

2.4 做好操作记录。

3 注意事项
操作过程中应严格执行定置管理规程和标准操作规程，严格控制洁净操作在规定范围内，注意安全操作和检定。

4 结束后的操作
4.1 清场
4.1.1 镜检结束后，操作人员应按相应的清洁标准操作规程对操作间、操作台面、设备、仪器、标本等进行清洁和标识。

4.1.2 清场工作完成后班组长应对清洁情况进行检查，确认合格后方可通知质量员进行清场效果的评价，只有当质量员检查合格并开具“清场合格证”正副本时，本次操作正式完成。

4.2 及时填写清场记录
5 岗位操作人员认真检查批检验记录上各项目都填写齐全，结果都在规定范围之内，复核后由班组长签字，质量员确认无误后签字，交质保员汇总。

6 “内容”变更点简述：
7 附表、附件、附录：
附件：显微镜检查批检验记录文件编号：SOP09-501-a-00
8 “附表、附件、附录”变更点简述。