质粒提取原理
采用碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA 与质粒DNA的变性与复性的差异不同而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开，DNA变性。
质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，留在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA及蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
Solution I：葡萄糖可增加溶液的年度，维持渗透压，防止染色体DNA受机械剪切作用而被降解，污染质粒DNA；溶菌酶（可省略）水解菌体细胞壁的化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，具有溶菌的作用。
当pH<8.0时，溶菌酶受到抑制；EDTA有两个作用：(1)螯合Mg2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解。
(2) EDTA的存在有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度环境；Tris-HCl作为缓冲溶液维持适当的浓度和pH值。
Solution II：NaOH，DNA在5.0<pH<9.0时时稳定的，但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而使DNA变性。
加Solution II后系统的pH高达12.6，线性染色体DNA和环型质粒DNA氢键均发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键只发生部分断裂，且其两条链不会发生完全分离，待pH调至中性闭合环型质粒DNA很快复性恢复原来的构型，而染色体DNA不能复性。
SDS 是阴离子表面活性剂，它有溶解膜蛋白破坏细胞膜，解聚细胞中核蛋白，能与蛋白质结合成为R-O-SO3-···R+-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但SDS能抑制RNase的作用，所以在以后提取中必须将其除干净。
Solution III：KAc-HAc缓冲体系pH约为4.8，一方面要将整个溶液体系调至中性，使变性质粒DNA能够复性并稳定存在；另一方面加入高浓度盐会导致SDS—蛋白质复合物，变性大分子染色体DNA、RNA 等凝聚沉淀，因为SDS (十二烷基硫酸钠)遇K+后变成PDS (十二烷基硫酸钾)，PDS是不溶于水的。
SDS喜欢和蛋白质结合成为SDS—蛋白复合物，而遇K+后形成PDS—蛋白复合物便凝聚沉淀下来，同时长长的染色体DNA部分和部分RNA也被PDS共沉淀下来。
酚-氯仿：都是非极性分子，而水是极性分子，当蛋白水溶液与酚-氯仿混合时，蛋白质分子间的水分子被酚-氯仿挤出去，使蛋白失去水合状态而变性。
变性蛋白质的密度比水的密度大，经过离心，与水相分离，沉淀在水相下面，而酚-氯仿比重更大，保留在最下层。
作为表面变性剂的酚-氯仿，在除去蛋白质的作用中，也有一些缺点：(1)酚与水有一定程度的互溶，酚相中水的溶解可达大约10％～15％，溶解在这部分水相中有DNA会损失；酚很容易氧化，变成粉红色，氧化的酚容易降解DNA，解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸，除去氧化的部分，再用Tris-HCl缓冲液饱和，使酚不至于夺去DNA中的水，带走部分DNA。
饱和酚中加上8-羟基硅啉及巯基乙醇，防止酚氧化，还是弱的螫合剂，可抑制DNase。
由于有颜色，溶解在酚中后，使酚带上颜色，便于酚相与水相的分离，酚饱和后，表面盖上一层Tris水溶液，隔绝空气，阻止酚氧化。
(2)氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水相溶，不会带走DNA，所以在抽提中混合使用。
异戊醇可以降低分子表面张力，减少抽提过程中泡沫的产生；同时，异戊醇有助于分相，使离心后的上层是水相，中层变性成蛋白相，下层为有机溶剂相。
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细菌的培养
●将5 ml含相应抗生素的液体培养基加入到容量
50 ml，且通气良好的Coning管中，然后接入
含质粒的细菌200 μl，于37℃振荡培养过夜；●取培养的菌液1.2 ml加入EP管中，4℃12000
rpm离心1 min；
●弃去上清液体培养基残液，使细菌沉淀尽可能
干燥，收集细菌。
碱裂解法提取质粒DNA
●在细菌沉淀中加入150 μl预冷的Solution I，剧
烈振荡重悬菌液至无颗粒沉淀，细菌完全悬浮；
●加入300 μl新鲜配制的Solution II，盖紧管盖，
温和快速的颠倒离心管数次，至溶液完全混匀；
●置于冰浴2 min使细胞完全裂解，染色体DNA
充分变性；
●加入225 μl预冷的Solution III，盖紧管盖，反
复颠倒EP管并轻轻振荡使溶液混匀，冰浴10 min，使质粒DNA复性；
●于4℃12000 rpm离心10 min，沉淀细胞碎片
和破碎的染色体DNA，将含质粒DNA的上清移入另一EP管；●加入与上清等体积的酚-氯仿，手指轻弹混匀，
4℃12000 rpm离心5 min，以沉淀变性蛋白；
●小心吸取上层水相至另一EP管，加入上清液2
倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀，于-20℃静置20 min沉淀质粒DNA；
●于4℃12000 rpm离心10 min，弃去上清液；
●加入1 ml70%的预冷乙醇，充分洗涤质粒DNA
沉淀，以达到洗盐目的；
●于4℃12000 rpm离心10 min，弃去上清液；
●将EP管倒置于滤纸上使乙醇充分流尽，并于
室温静置15 min让乙醇完全挥发；
●加入20 μl无菌超纯水，充分溶解质粒DNA，
-20℃储存备用。
试剂配制
●Solution I
✓葡萄糖50 mmol/L
✓Tris-HCl (pH8.0) 25 mmol/L
✓EDTANa2 10mmol/L
●Solution II
✓NaOH 0.2 mmol/L
✓SDS 1%
✓可先制成NaOH 0.4 mmol/L、SDS 2%，临用时1:1混合现配●Solution III
✓KAc(5 mmol/L) 60 ml
✓冰乙酸11.5 ml
✓ddH2O 28.5 ml
✓溶液配置成100 ml，pH调至4.8，配好后S-III 溶液含3 mol/L钾盐、5mol/L乙酸。
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