罗氏 (Roche)公司 Tunel 试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL （TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA 的断裂情况。
其原理是荧光素（ fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（ TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的3’-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联苯胺（DAB ）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3‘-OH 形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1 号（蓝盖） Enzyme Solution 酶溶液： TdT 10×、2号（紫盖） Label Solution 标记液：荧光素标记的 dUTP 1×、3号（棕瓶） Converter-POD:标记荧光素抗体的 HRP；自备试剂： PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB 工作液（临用前配制， 5 μl 20 ×DAB+1 μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（ 10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl ，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于 0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、 DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ，pH 7.5， 10 mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA ）等。
三、实验步骤操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL 反应液→加 converter-POD→与底物 DAB 反应显色→光学显微镜计数并拍照。
具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1.用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min；2.用梯度乙醇（ 100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4.用 Proteinase K工作液处理组织 15-30 min 在 21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400μg/mL ）处理 5 分钟。
其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶 K 处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液：0.1%TritonX-100 溶于 0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于 HCl PH2 ，胰蛋白酶 0.25%-0.5%溶于 0.01N HCl ）替代方法3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M 的柠檬酸缓冲液 PH 6 的塑料盒中，置于微波炉中 350W（低档）处理 5 min。
5.PBS 漂洗 2 次；6.制备 TUNEL 反应混合液：处理组用 50μl 1 号液+450μl 2 号液混匀；而阴性对照组仅加50μl 2号液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在 15~25℃× 10min，后面步骤同处理组。
7.玻片干后，加 50μl TUNEL 反应混合液（阴性对照组仅加 50μl 2号液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃× 1h。
8.PBS 漂洗 3 次；9.可以加 1 滴 PBS 在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为 515~565nm）；10.玻片干后加 50μl 3号液（ converter-POD）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应 37℃× 30min。
11.PBS漂洗 3 次；12.在组织处加 50~100μl DAB 底物，反应 15~25℃× 10min；13.PBS 漂洗 3 次；14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。
梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
15.加一滴 PBS 或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500 个细胞）并拍照。
可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状 /凋亡小体）对于培养细胞的预处理：①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，干燥后 4℃保存；②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106 个细胞， PBS 洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的载玻片在 4%多聚甲醛中固定 25min；④PBS 浸洗二次，每次 5min；⑤将吸附细胞的载玻片在 0.2%的 Triton X-100 中处理 5min；⑥PBS 浸洗二次，每次 5min；后续操作如同石蜡包埋切片的6-15四、注意事项1.进行 PBS 清洗时，每次清洗 5 min。
2.PBS 清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去 PBS 溶液后再进行下一步反应。
3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4.TUNEL 反应液临用前配制，短时间在冰上保存。
不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
5.如果 20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
6.用甲基绿（ Methyl Green）染液（ 3-5%甲基绿溶于 0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。
然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。
如果此时使用 80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。
7.2 号液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。
8.试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；3号液（converter -POD）液一旦解冻，以后就保存在 4℃（ 2~8℃）下，至少在 6 m 内稳定，避免再次冻存；TUNEL 反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。
9.结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖 /代谢的组织细胞中可产生大量 DNA 片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏 DNA 断裂或 DNA 裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止 TdT 进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
常见问题的原因及推荐解决方案现象非特异性染色可能原因建议TdT 酶的浓度过高用 TdT dilution buffer* 作 1︰ 2—1︰ 10 稀释TdT 酶反应时间过长或 TdT 酶反应过程中反应液注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。
很好地覆盖样品。
光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂会导致样本 DNA 的断裂）在固定组织时样本 DNA 已断裂（内源核酸酶的作确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注用）固定使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液采用推荐的固定液固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA 断裂用含有 dUTP 和 dAPT 的溶液封闭如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因用溶于 PBS PH7.4 中的 4%多聚甲醛固定为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中或福尔马林或戊二醛固定。
丢失）标记率低荧光背景很高固定时间过长，导致交联程度过高荧光淬灭促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低支原体污染TdT 酶的浓度过高或反应时间过长红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。
高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
减少固定时间，或用溶于 PBS PH7.4 的2%多聚甲醛固定Fluorescence 在普通光照 10 分钟就会严重淬灭，需注意避光操作1、增加通透剂促渗时间2、增加通透剂的作用温度（15-25 ℃）3、优化蛋白酶K 的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml 作用 5min）4、0.1M 的柠檬酸钠70℃作用 30min 。
请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染用TdT dilution buffer* 作 1︰2— 1︰10 稀释或注意控制反应时间宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
1、冷冻切片使用3u/ml的DNase I阳性对照DNase I 的浓度过低2、石蜡切片使用1500u/ml 的DNase I 没有信号3、一般样本使用10u/ml DNase I组织样本从载玻片组织样本被酶从玻片消化下来降低蛋白酶K的处理时间脱落TdT dilution buffer ：60 mMKPB缓冲液（pH7.2），150 mMKCl，1 mM2-mercaptoethanol，50 %Glycerol。