目录第一章芽孢杆菌的简要介绍 (1)第一节芽孢杆菌种类 (1)第二节芽孢杆菌表达系统发展简史 (2)第二章枯草芽孢杆菌的转化系统 (3)第一种方法：电转化 (3)第二种方法：Spizizen转化 (3)第三种方法：原生质体法(Takashi) (4)第四种方法：原生质体转化之二 (4)第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐） (5)第三章芽孢杆菌表达系统发展简史 (6)第一节芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） (7)第二节芽孢杆菌的缺点 (7)第三节助表达系统 (7)第四节芽孢杆菌基因表达的主要特点 (7)第四章枯草芽孢杆菌转录翻译系统 (8)第一节：转录系统 (9)第二节：翻译系统 (9)第五章芽孢杆菌常用的宿主和载体 (10)第六章芽孢杆菌表达系统应用实例 (11)1 中国 (11)2 日本 (12)3 加拿大 (12)第七章芽孢杆菌其他产品 (13)第一节核苷类产品 (13)第二节核黄素 (13)第三节微生物制剂/益生菌 (13)第八章结语 (14)附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 (14)附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 (15)致谢及参考文献 (15)第一章芽孢杆菌的简要介绍芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。
目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。
尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。
芽孢杆菌是一个泛泛的概念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如168菌株及其大量的衍生菌株。
枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株。
目前应用最多的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种。
第一节芽孢杆菌种类目前，芽孢杆菌属很多菌株的全基因组序列已经报道，截至2011年10月，在KEGG 上公布全基因组序列的芽孢杆菌属菌种有：简称菌种名称测序时间测序链接bsu Bacillus subtilis1997RefSeqbss Bacillus subtilis subsp. spizizenii W232010RefSeqbst Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-102011 RefSeqbsn Bacillus subtilis BSn52011RefSeqbha Bacillus halodurans2000RefSeqban Bacillus anthracis Ames2003RefSeqbar Bacillus anthracis Ames 05812004RefSeqbat Bacillus anthracis Sterne2004 RefSeqbah Bacillus anthracis CDC 6842009 RefSeqbai Bacillus anthracis A02482009 RefSeqbal Bacillus cereus biovar anthracis CI2010RefSeqbce Bacillus cereus ATCC 145792003RefSeqbca Bacillus cereus ATCC 109872004RefSeqbcz Bacillus cereus ZK2004RefSeqbcr Bacillus cereus AH1872008 RefSeqbcb Bacillus cereus B42642008 RefSeqbcu Bacillus cereus AH8202009 RefSeqbcg Bacillus cereus G9******* RefSeqbcq Bacillus cereus Q12009RefSeqbcx Bacillus cereus 03BB1022009 RefSeqbcy Bacillus cytotoxis NVH 391-982007RefSeqbtk Bacillus thuringiensis 97-272004RefSeqbtl Bacillus thuringiensis Al Hakam2006RefSeqbtb Bacillus thuringiensis BMB1712010RefSeqbwe Bacillus weihenstephanensis2008 RefSeqbli Bacillus licheniformis ATCC 145802004RefSeqbld Bacillus licheniformis DSM132004RefSeqbay Bacillus amyloliquefaciens FZB422007RefSeqbao Bacillus amyloliquefaciens DSM 72010RefSeqbae Bacillus atrophaeus2010 RefSeqbcl Bacillus clausii2005 RefSeqbpu Bacillus pumilus2007RefSeqbpf Bacillus pseudofirmus2010 RefSeqbmq Bacillus megaterium QM B15512010 RefSeqbmd Bacillus megaterium DSM 3192010 RefSeqbse Bacillus selenitireducens2010 RefSeqbco Bacillus cellulosilyticus2011 RefSeqbck Bacillus coagulans2011 RefSeqbag Bacillus coagulans 36D12011 RefSeq第二节芽孢杆菌表达系统发展简史芽孢杆菌表达系统是在70年代从枯草芽孢杆菌，又称枯草杆菌（Bacillus subtilis）开始，逐步扩展至其它种的。
枯草杆菌能发展成为芽孢杆菌中的第一个基因工程表达系统是与其早期的遗传学工作密切相关的。
Spizizen于1958年发现枯草杆菌168菌株为可转化菌株以来，枯草杆菌的遗传学工作不断深入和发展。
美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心（BGSC，/）至1999年保藏的168菌株的遗传突变株就有890个。
它牵涉到了诸多营养要求、各种酶、芽孢形成和发芽、感受态、Sigma因子、DNA重组与修复以及正负调控等各方面基因的突变体。
70年代发明了DNA重组技术以后，特别是发现金黄色葡萄球菌的带有抗性标志的质粒可作为枯草杆菌的载体以后，克服了枯草杆菌只有隐秘性质粒的困难，枯草杆菌基因工程的工作更是加速发展。
迄今，已经在枯草杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核和真核基因，其中有的已应用于工业化生产，取得了不少成绩。
将携有外源基因载体导入宿主细菌中是细菌基因工程表达系统的必要条件。
大肠杆菌（G-）的氯化钙转化法对枯草杆菌无效，所以枯草杆菌基因工程表达系统中的宿主菌株用的最广泛的就是在DNA重组技术发明之前就可以进行感受态转化（Spizizen 1958）的168菌株及其突变体。
Spizizen感受态转化的基本原理：是细胞在Spizizen最低盐培养基中形成一段饥饿、易于摄取外源DNA片段的时期。
一般步骤是先将其在较为丰富的培养基中培养，然后转接到贫瘠的培养基中，使其形成感受态（一般非常短暂）。
有关感受态时期参与摄取外源DNA的几种蛋白及其摄取机制已有初步的研究。
第二章枯草芽孢杆菌的转化系统第一种方法：电转化实验试剂：GM:LB+0.5M 山梨醇ETM:0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油RM：LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇电转仪：eppendorf方法（本人亲自验证，使用的菌株为WB600）：1）新鲜平板挑单菌落（小一点为好）接种于5ml LB培养基中，过夜培养.。
2）测量摇管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。
培养基为50ml GM。
37℃，200rpm培养至OD600=1.0（大约3-4小时）左右。
3）取全部菌液冰水浴10 min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。
4）用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。
5）将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl.6）将60μl感受态细胞中加入1-6 μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。
电转仪设置：2.0kv（另外我还尝试过0.8kv，1.2kv），25μF200Ω，1mm，电击1次. （持续时间4.5ms-5ms之间）7）电击完毕立即加入1ml 复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。
37℃，过夜培养第二种方法：Spizizen转化取新鲜活化菌种一环接入装有5mLGM1培养基的试管中，37℃、200rpm培养过夜，取500μL菌液转接入相同的GM1培养基中，37℃、200rpm培养4-5小时使菌体生长达到对数期末期，然后取0.75mL GM1菌液接入装有5mLGM2培养基的试管中，37℃、200rpm培养1.5小时，制得感受态细胞，将待转化质粒DNA与1mL感受态细胞混匀后在37℃静置1小时，然后37℃，200rpm震荡培养1-1.5小时，取适量菌悬液涂布选择培养基，37℃培养24-48h后，挑选转化子。
10×Spizizen基本盐培养基(g/L)：(NH4)2SO4 2，K2HPO4 8.3，KH2PO4 6，柠檬酸钠1.2，无离子水配制。
0.1Mpa压力下灭菌20min。
Spizizen基本培养基：10×Spizzen基本盐培养基100ml/L，50%(w/v)葡萄糖10ml/L，色氨酸母液（5mg/ml）10ml/L，琼脂1.5%（w/v）。
0.06Mpa压力下灭菌20min。
GM1培养基和GM2培养基：母液0.1Mpa压力下灭菌20min后按下表混合。
母液GM1培养基GM2培养基40%葡萄糖100μL 100μL20mg/mL酸水解酪素100μL 50μL50mg/mL酵母抽提物100μL 0μL20%(w/w)MgSO4.7H2O 5μL 40μL10×Spizzen基本培养基500μL 500μLH2O 3195μL3310μL总体积5000μL 5000μL第三种方法：原生质体法(Takashi)1、活化：从活化24小时新鲜的CM平板上挑取单个菌落，接种于30ml CM液体培养基中，37℃过夜培养。