缺点：
•可检测到的肽段少，对数据库检索是不利的。 • 肽段分子量精确度往往不够理想，影响鉴定结果。肽段分子质量在 2000以上时，在MALDI-TOF-MS中的分辨率会有所下降 。 •无法进行混合蛋白质鉴定 •翻译后修饰鉴定能力稍低
LTQ（ESI-MS/MS）
由于该质谱具有高效液相分离与MS/MS结构分析功能，可以获得检测到 的每一肽段的序列。根据一级质谱(MS)测得的精确分子质量和串联质谱 (MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。 优点：
总离子可信度
肽段序列
实际分子量 理论分子量
起始氨基酸位置 结束氨基酸位置
肽段离子得分
肽段固定修饰
分子量误差
肽段可信度
MS-MS (SeQuest)
BuildSummary
LTQ质谱（BuildSummary软件）结果说明
唯一肽段数 鉴定的肽段数 搜索到的蛋白 蛋白鉴定覆盖率 蛋白理论分子量 蛋白理论等电点 搜索到的蛋白可能有多个gi号，取最典型的gi号，选取次序为：sp > ref > first gi_number
• MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激 光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子 或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软 电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。
• TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器 的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行 时间成正比 ，检测离子。
压力差推动质子化样品进入质 量分析器进行检测 。
实验原理
适用样品
• 一般建议样品为溶液或考染胶。若为银染胶，需要采取快 速银染（即同质谱鉴定兼容）的方法染色。 • 溶液中一般不要有SDS、CHAPS、Triton X-100、NP40及 吐温 20、40等系列的去污剂。盐浓度小于50mM • 溶液样品蛋白浓度一般不小于1mg/ml，蛋白总量不小于 10ug。
该肽段对应的蛋白数
五．MALDI-TOF/TOF与LTQ进行蛋白质鉴定的比较
MALDI-TOF/TOF 根据肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)与蛋白质 数据库中蛋白质的理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质。或者根据二 级质谱图谱查库鉴定蛋白质。 优点： 速度快，通量高，方法简便。
• 蛋白质为未知蛋白，造成鉴定无结果。
• 蛋白质降解或翻译后引起质谱鉴定蛋白质与凝胶上蛋白质 的分子量等电点差异较大。
七． 生物质谱的应用
• • • • • • • • • 蛋白质/多肽肽质谱图 蛋白质/多肽分子量测定（MS） 溶液及胶内蛋白质/多肽的质谱鉴定 蛋白质突变点鉴定 蛋白质磷酸化分析 蛋白质糖基化分析 复杂蛋白质混合物鉴定（Shotgun-MS） 蛋白质iTRAQ差异定量 蛋白质修饰位点分析
双聚焦分 析器
四级杆质 量过滤器
傅立叶回旋共振 飞行时间 （TOF） （FT-ICR） (Ion Trap）
离子阱
二．蛋白质质谱鉴定的常规流程
•
•
蛋白质胶内酶解
质谱分析
•
•
数据库查询
生物信息学分析（可选）
蛋白质点的胶内酶解
• 凝胶的脱色 – 考染 – 质谱兼容的银染 • 凝胶点的缓冲液转化 • 加入胰蛋白酶 • 抽提多肽分子
适用样品
• 双向电泳凝胶点 • 经过纯化的蛋白溶液或单一的SDS-PAGE条带 • 考染或质谱兼容银染凝胶样品均可以检测
PMF图谱
MS/MS图谱
ESI-LC-MS/MS分析
基本原理：
通过样品溶液在毛细管喷雾口
形成液滴，在强电场和热的干
燥气的共同作用下，液滴逐渐 被气化，同时也被质子化；喷
雾口与离子聚焦传输区之间的
这三个蛋白鉴定了完全相同的肽段，因此归为同一个group，称为一个鉴定蛋白群
搜索的质谱文件 肽段电荷数 搜索到的肽段 肽段理论质荷比 理论质荷比与实际检 测到的质荷比的差值 该肽段在该质谱文件 搜索结果中排名 XCorr
DeltaCn 预打分得分 该肽段在预打分结果中排名 理论谱与实验谱的离子匹配 数 | 理论谱中离子数 该肽段对应的蛋白 该肽段对应的蛋白群数
三．质谱分析
• MALDI-TOF分析（PMF） • MALDI-TOF/TOF分析 • LTQ分析 • 其他质谱分析（Q-TOF等）
MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF分析
基本原理
• MALDI-TOF/TOF（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 ） 仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和 飞行时间质量分析器（TOF）。
来分析蛋白质和多肽的分子量和对蛋白质进行鉴定,定量及
其修饰点分析。一台质谱仪一般有进样装置，离子化源，
质量分析器，离子检测器和数据分析系统组成。
串联质谱
离子源 质量分析器 质量分析器 检测器 数据处 理系统
质量选择器
Tandem in Space QQQ Q-Trap Q-TOF IT-TOF TOF-TOF Tandam in Time Ion Trap (2D, 3D) FTICR Trap-FT
•
• •
对图谱的精确度和分辨率要求不如PMF高。
可进行混合蛋白质鉴定 翻译后修饰鉴定能力较强：如磷酸化位点分析
•
•
通过同位素标记蛋白质，该种质谱可直接进行差异蛋白质定量分析
缺点： 通量与速度不如MALDI。
•
数据库检索比较费时。
六．蛋白质鉴定结果常见问题
• 角蛋白等蛋白质的污染，造成鉴定为污染蛋白。 • 蛋白量过少或含盐太多引起鉴定结果的评分低，可信度不 高。 • 蛋白质纯度不足，造成鉴定结果为混合蛋白质。
• • • • •
• • •
生物质谱分类
进样系统
不连续进样：适用于固体 或高沸点液体
MALDI 连续进样：分析样品连续进入 GC/MS,LC/MS
离子化方式
热不稳定化合物 快原子轰击离子化（FAB）
热稳定化合物 电子离子化（EI） 化学离子化（CI）
基质辅助激光解析离子化（MALDI）
质量分析器
电喷雾离子化（ESI）
Basepeak图谱
MS/MS图谱
四．数据库的查询
• MASCOT
• SEQUEST
MASCOTC数据库搜索
MALDI-TOF/TOF结果文件主要参数说明
蛋白登录号 理论分子量 样品靶位 检测到的肽段数 蛋白质得分 蛋白质 可信度 理论等电点 总离子得分
蛋白 排名 肽段 信息
蛋白名称及物种
蛋白质质谱
一．概述
• 蛋白质组学中的质谱鉴定，是使用生物质谱技术对特异 性酶解的多肽分子进行分析，从而得到对应的序列信息 • 质谱分析分成两种 – 多肽分子的质量电荷比的测量( fullscan和PMF) – 多肽分子的碎片分子的质量电荷比测量(MS/MS质谱 图谱）
生物质谱原理
基本原理：
将样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比(m/z)的差异
质谱技术在蛋白质组研究中的应用
Hale Waihona Puke 研究目的表达谱构建 蛋白质相互作用研究 蛋白质表达差异分析 蛋白质翻译后修饰分析
蛋白质组学方法
大规模蛋白质鉴定技术（shotgun） 大规模蛋白质鉴定技术（shotgun） 定量蛋白质组学技术 磷酸化，泛素化位点鉴定技术