基因工程中各种工具酶的比较
分类
常用酶
作用特点
主要用途
限制性内切酶
Ⅱ型
能识别特定的序列,且切割位点特定
产生黏性末端
DNA连接酶
T4 DNA连接酶
末端必须带有3'-OH和5'-P;只能连接双链DNA分子;只能连接双螺旋DNA上的缺口,不能连接单链上的裂口
可连接DNA-RNA和RNA-RNA杂合体；反应需ATP
具强RNase H活性
①合成cDNA;②合成DNA探针;③合成cDNA第一链
鼠源
具弱RNase H活性
DNA修饰酶
末端脱氧核苷酸转移酶
需3’-OH、二甲胂酸缓冲液;不需模板;底物可为单链DNA、3’-OH突出的双链DNA或平末端（Co2+）
同聚物加尾;再生酶切位点,便于回收克隆片断;非/放射性标记DNA片断的3’端
RNA酶
核糖核酸酶A
①可特异性攻击RNA上嘧啶残基的3'端;②在无辅助因子及二价阳离子存在时,其活性可被特异性酶抑制剂Rnasin或氧钒核糖核苷复合物所抑制;③不易失活
①去除DNA:RNA或RNA:RNA杂合体中未杂合的RNA区域;②降解DNA制备物中的RNA分子;③确定DNA或RNA中单碱基突变的位置;④对RNA进行定量分析和作图
T4多核苷酸激酶
不论’-OH端突出与否,均能重新磷酸化
DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端
碱性磷酸酶
DNA5’端去磷酸化
防止线性化的载体分子自我连接
外切核酸酶
作用于单链
大肠杆菌外切核酸酶Ⅶ
能从单链DNA的3'末端和5'末端同时消化DNA,产生寡核苷酸片段
从PCR终末产物中去掉引物;用于测定基因组DNA中内含子和外显子的位置;回收按dA-dT加尾法插入到质粒载体上的cDNA片段
诱发DNA缺失突变
脱氧核糖核酸酶Ⅰ
能从嘧啶核苷酸5'端磷酸基处随机降解单链或双链DNA;当有Mg2+存在时,能在双链DNA上随机独立地产生切口;当有Mn2+存在时,可产生平末端DNA片段
切口平移位点;去除转录产物中的模板DNA
用于匀速控制DNA双链降解
单链内切核酸酶
S1核酸酶
①催化反应需Zn2+和酸性条件;②可高特异性地降解单链DNA和RNA,反应产物为5'单核苷酸;③可用于切割双链DNA的单链缺刻,但不能识别单个碱基对的错配
用于切除DNA片段的单链突出末端以产生平末端,切除发夹结构;在DNA上定位
Bal31核酸酶
对单链DNA具有特异的内切酶活性,对双链DNA表现为两种外切酶活性;降解DNA需Ca2+存在
作用于双链
大肠杆菌外切核酸酶Ⅲ
切割位点为3'-OH末端;反应需Mg2+或Mn2+
制备特异性的放射性探针;制备单链DNA模板;构建单向缺失
λ噬菌体外切核酸酶
切割位点为5’-P末端
将双链DNA转变成单链的DNA，进行DNA序列分析；移去5’突出末端，便于加尾
T7噬菌体基因6外切核酸酶
切割位点为5’-P和5’-OH末端，活性低于λ噬菌体外切核酸酶
核糖核酸酶H
可特异性地降解DNA:RNA杂合链中RNA部分,但不能降解单链或双链的DNA(或RNA)
参与合成cDNA的第二条互补链;对特定基因的表达进行调控
核糖核酸酶T1
能特异性地作用于鸟嘌呤3'-P
对RNA进行定量和作图;用于除去DNA:RNA杂合体中未杂交RNA区域
性;③5'→3'聚合酶活性(需Mg2+)
制备带放射性标记的DNA探针;合成cDNA第二链;标记DNA分子3'突出末端
Klenow片段
①3'→5'外切酶活性;②5'→3'聚合酶活性
3'→5'外切酶活性低
补平或标记3'凹陷末端;合成cDNA第二链;DNA序列分析;合成杂交探针
T4 DNA聚合酶
3'→5'外切酶活性强
反应需DTT
通过形成磷酸二酯键，将两条DNA片段连接起来
大肠杆菌DNA连接酶
不能连接DNA-RNA和RNA-RNA杂合体;反应需NAD+
反应不需巯基试剂；可被胰蛋白酶水解
热稳定DNA连接酶
反应需巯基试剂
DNA聚合酶
依赖于DNA
大肠杆菌聚合酶Ⅰ
①5'→3'外切酶活性(具有5'-P);②3'→5'外切酶活
补平隐蔽末端;DNA3’末端标记;转化为平末端
T7聚合酶
3'→5'外切酶活性最强；持续结合能力最强,且不受DNA二级结构影响
①催化大分子量DNA合成;②进行末端标记;③补平隐蔽末端
Taq DNA聚合酶
无3'→5'外切酶活性;反应需Mg2+
将PCR产物与载体相连
依赖于RNA
反转录酶
禽源
5'→3'和3'→5'外切酶活性均无