▪ 如果平板上出现链状菌落，菌落间没有明 显的界限，这可能是琼脂与检样混匀时， 一个细菌块被分散所造成的。一条链作为 一个菌落计。若培养过程中遭遇昆虫侵入， 在昆虫爬行过的地方也会出现链状菌落， 也不应分开计数。
▪ 如果平板上菌落太多，不能计数时，不能 用多不可计作报告。应在最高稀释度平板 上任意选取2个1cm2的面积，计算菌落数， 除2求出每cm2面积内平均菌落数，乘以 63.6(皿底面积cm2数)。
▪ 按上述操作制备10倍系列稀释样品匀液。每 递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
▪ 根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适 宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原 液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度 分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同 时分别取1mL稀释液加入2个无菌平皿作空白 对照。
▪ 及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼 脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中 保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
▪ 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫 生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖 一薄层琼脂培养基（约4mL）。
培养
▪ 琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养 48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。
▪ 如果检样是微生物类制剂（酸牛奶、酵母 制酸性饮料等），在进行菌落计数时应将 有关微生物（乳酸菌、酵母菌）排除，不 可并入检样的菌落总数内作报告。
▪ 在进行菌落计数时，检样中的霉菌和酵母 菌也不应计数。
第二法 PetrifilmTM 细菌总数试片法
PetrifilmTM 细菌总数试片法
▪ 原理：细菌具有脱氢酶能使相应的底物脱氢 而释放出氢离子，培养基中的TTC作为氢离 子的受体，在接受氢离子后被还原为红色非 溶解性产物，从而使细菌着色，达到易观察、 便计数的效果。
谢谢!
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平板接种与培养：
▪ 根据食品卫生标准要求和对样品污染情况 的估计，选择2~3个稀释度。加入样品时要 注意外来的污染。
▪ 培养基倾注的温度与厚度是实验正确与否 的关键。（倾注的温度：一般35~45℃，温 度过高会造成已受损伤的菌细胞死亡。厚 度：直径9cm的平皿一般要求15~20mL培养 基，若培养基太薄，在培养过程中可能因 水分蒸发而影响细菌的生长）。
关于均质器使用效果和对检测结果的影响， 有不同的报道： 不同食品样品采用不同的均质方法，测试 结果不同 。 不同的均质方式对金黄色葡萄球菌和大肠 杆菌的检测的影响也不同。
菌落总数的检验程序图
检样 10倍系列稀释 选择2~3个适宜样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养平皿内
每皿内加入适量培养基 (PCA)
▪ 按菌落总数平板计数法的样品制备方法进行。
▪ 样品匀液的pH值应在6.5～7.2之间，pH值过低 或过高时分别用1M NaOH或1M HCl予以调节。
▪ 合理稀释度的选择，每稀释度接种2张测试片。
▪ 接种时避免气泡产生。
▪ 培养基未凝固时勿挪动。
▪ 将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片 数不超过20片。
▪ 缺点：
▪ 某些有红色颗粒的，需要注意；粘稠的液 体样品，不易分散开；表面活性比较大， 易流出；泡沫比较丰富的样品等
▪ 颜色特别重的，如桔黄色，掩盖了菌落；
▪ 抑菌剂浓度比较高时；辣根及辣根粉、大 蒜及洋葱制品；
▪ 某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或 菌落模糊的现象，大部分是芽胞杆菌。
操作要点
▪ 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300， 则对稀释度最高的平板进行计数，其他平 板可记录为多不可计，结果按平均菌落数 乘以最高稀释倍数计算。
▪ 若所有稀释度的平板上菌落数均小于30， 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释 倍数计算。
▪ 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无 菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计 算。
36±１℃ 48±2h
菌落计数
报告
样品的稀释
▪ 固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均 质杯内，8000r/min～10000 r/min均质1min～ 2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质 袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制 成1:10的样品匀液。
第一法 平板计数法
培养基改变情况
平板计数琼脂 （PCA)
胰蛋白胨 酵母浸膏 葡萄糖 琼脂 蒸馏水
5.0g 2.5g 1.0g 15.0g 1000mL
营养琼脂（NA)
蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 琼脂 蒸馏水
10.0g 3.0g 5.0g 15.0g 1000mL
样品处理添加了拍打式均质器 或等效的设备
计算公式
▪ 公式使用的前提：有两个连续稀释度在适宜 计数范围内（30～300个菌落数）
N = ∑C / [n1 + (0.1 × n2) ] × (d) N ： 样品中菌落数 ∑C ：平板菌落数之和 n1：个适数宜范围菌落数的第一稀释度（低）平板 n2：个适数宜范围菌落数的第二稀释度（高）平板 d： 第一稀释度（低）
培养温度: 每种不同样品中的细菌都有一定的生理特
性，培养时应用不同的营养条件及生理条件 可能得出不同的结果，因而应根据检测标准 的要求选择适当的培养温度和培养时间。
▪ 食品：36±１℃， 48±2h 。 ▪ 饮用水：36±１℃， 48h 。 ▪ 水产品：30±１℃， 72±3h。 (36℃培养和
30℃培养结果差别较大，同样水产品48h结果 和72h也有差别。)
菌落计数
▪ 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数 器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落 计数以菌落形成单位（colony-forming units， cfu）表示。
▪ 选取菌落数在30cfu～300cfu之间、无蔓延菌 落生长的平板计数菌落总数。低于30cfu的平 板记录具体菌落数，大于300cfu的可记录为 多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个 平板的平均数。
▪ 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌 落蔓延。
▪ 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
▪ 称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/mL 为单位报告。
菌落总数计算公式的改变
▪ 统计学依据： • 平板菌落数越多，结果越具有代表性； （不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等） • 取样量越大，结果越具有代表性； （同等取样条件、排除其他方面的干扰因素）
▪ 若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300 之间，其中一部分大于300或小于30时，则 以最接近30或平均菌落数乘以稀释倍 数计算。
菌落总数的报告
▪ 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约。
▪ 大于或等于100时，第3位数字采用“四舍五入” 原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来 表示结果；也可以用10的指数形式来表示，此时 也按“四舍五入”原则修约采用两位有效数字。
结果的表述-菌落总数的计算方法
▪ 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜 计数范围内，计算两个平板菌落数的平均 值再将平均值乘以相应的稀释倍数，作为 每g(ml)中的菌落总数结果。
▪ 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜 计数范围内时，按下列公式计算： N = ∑C / [n1 + (0.1 × n2) ] × (d)
▪ 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则 不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板 作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到 平板的一半，而其余一半中菌落分布又很 均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表 一个平板菌落数。
▪ 平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无 明显界线)，则应将每条链（不同来源） 作为一个菌落计。
▪ 优点：
▪ 培养基具有良好的生产质量；
▪ 菌落计数特别方便（容易判读），红色菌落， 易于食品颗粒分开，无菌落重叠现象；
▪ 方格设计，便于计数；
▪ 菌落分布特别均匀；
▪ 平行平板菌落结果一致性比较好，这与避 免了培养基对细菌热损伤有关；
▪ 菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生；
▪ 安全方面：不像玻璃平皿易碎、对人员造 成潜在的伤害，另外密封比较好，不容易 直接接触。
▪ 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛 有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无 菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠) 中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
▪ 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品 匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液 的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触 及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸 管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品 匀液。
计算范例
稀释度 菌落数
1:100（第一稀释度） 232，244
1:1000（第二稀释度） 33，35
N
C (n10.1n2)d
[2 2 3 (0 2 .1 2 4 2 )3 ] 4 1 3 3 2 0 52 .2 5 14 2 0 424 7 22 57 0
检样稀释：
▪ 检样稀释时，应以无菌操作称取或量取有 代表性在样品25g（25mL）置225mL灭菌稀 释液中。固体样品应剪碎，以拍打式样品 处理器做成样品悬液（1：10）。
对照试验：
▪ 检样的稀释液中往往带有食品颗粒，在这 种情况下，为避免与细菌菌落混淆，可作 一检样对照，不经培养，置4℃环境放置， 在计数时用于对照。
▪ 或可选用TTC营养琼脂作培养基。
菌落计数：
▪ 如果高稀释度平板上的菌落数比低稀释度 平板上的菌落数高，则说明检验过程中可 能出现差错或样品中含抑菌物质，这样的 结果不 可用于结果报告。
▪ 为防止细菌增殖及产生片状菌落，在加入样 液后，应在20min内倾注培养基。检样与培 养基混匀时，可先向一个方向旋转，然后再 向相反方向旋转。旋转中应防止混合物溅到 皿边的上方。
▪ 培养基凝固后，应尽快将平皿翻转培养，保 持琼脂表面干燥，尽量避免菌落蔓延生长， 影响计数。