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基因缺失
基因缺失可以是1-2个碱基，也可以是一个 片段甚或一个外显子的缺失。基因片段的缺 失可使该基因激活，转录异常，使基因正常 的生物学功能丧失。在肿瘤发生中，多为抑 癌基因的缺失。 常见的抑癌基因缺失包括： RB - the retinoblastoma gen p53 gene p16-INK4a
多害少利性：多数有害,少数有利 意义：新基因产生的途径，是生物变异的根本来源， 是生物进化的途径。
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点突变的实例： 镰刀型细胞贫血症的形成
病人的血红蛋白的一条多肽链发生了什么变化？
正常 异常
…－脯氨酸－谷氨酸－谷氨酸—…
… －脯氨酸－缬氨酸－谷氨酸 —…
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点突变的实例：镰刀型细胞贫血症
DNA
缺 失
┯┯┯ ＡＧＣ ＴＣＧ ┷┷┷
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基因突变的原因和类型
物理因素 外界因素
原因
化学因素
生物因素
内部因素
自然突变
DNA修复功能减弱
类型 人工诱变
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基因突变的特点和意义
普遍性: 随机性: 特点 生物界中普遍存在 可发生在生物个体发育任何时期
不定向性： 突变无明显偏倚 低频性: 自然状态下突变频率很低10－5-10-8
H-, K-, N-ras, src, raf,
N-, c-, L-myc, c-jun, fos PRAD1 (cyclin D) bcl-2, bcl-X
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肿瘤突变—取样的特殊性
Sample Selection by Laser Capture Microdissection
注意事项：必须从肿瘤组织中取样
ETV家族常见融合基因
5' partner TMPRSS2 TMPRSS2 TMPRSS2 HERV-K_22q11.23 SLC45A3 C15orf21 HNRPA2B1 KLK2 CANT1 ACSL3 SLC45A3 FLJ35294 DDX5 TMPRSS2 SLC45A3 EST14 HERVK17 Class I I I II II III IV II II II II II IV I II II II 3' partner ERG ETV1 ETV4 ETV1 ETV1 ETV1 ETV1 ETV4 ETV4 ETV1 ERG ETV1 ETV1 ETV5 ETV5 ETV1 ETV1
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一、基因突变的定义
DNA分子中发生碱基对的 替换 、增添和 缺失，而引起的基因序列的改变
┯┯┯┯ ＡＴＧＣ ＴＡＣＧ ┷┷┷┷ ┯┯┯┯ ＡＴＧＣ ＴＡＣＧ ┷┷┷┷ ┯┯┯┯ ＡＴＧＣ ＴＡＣＧ ┷┷┷┷
替 换
┯┯┯┯ ＡＣＧＣ ＴＧＣＧ ┷┷┷┷
增 添
┯┯┯┯┯ ＡＴＡＧＣ ＴＡＴＣＧ ┷┷┷┷┷
mRNA 氨基酸
GAA CTT
GAA 谷氨酸 正常
突变
GTA CAT GUA 缬氨酸 异常
根本 _____原因
_____原因 直接
蛋白质
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与肿瘤相关的常见点突变
类型 生长因子 生长因子受体 基因 Sis, α-TGF, Erb (EGFR), HER2/neu,
细胞信号传导因子
转录因子 细胞周期因子 凋亡相关基因
重组DNA技术操作的主要步骤 载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成
PCR产物
开环载体DNA
限制酶消化 连接酶
目的基因
转化 体外包装，转染
重组体
带重组体的宿主
筛选
表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交
几种不同的蛋白表达系统
T7 promoter
Nco I (70)
临床基因扩增实验室检测 培训课程
基因突变重组 与检测技术
卫生部北京医院 肖飞
内容介绍
一、基因突变的产生与后果
二、基因重组技术 三、基因突变的检测方法
1. 分子杂交技术 2. 基因测序技术 3. 高通量基因测序技术
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遗传中心法则回顾
复 制
转录
翻译
逆转录
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第一节
基因突变的产生与后果
基因突变的种类 点突变 基因缺失 插入 基因异位或重排 表观遗传学
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基因重组—转位

转位：一个或 一组基因从一 处转到基因组 的另一个位置。

这些游动的基 因称为转位子 (transposon)。
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基因工程技术
基因工程(genetic engineering) —— 实现基
因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，
又称重组DNA工艺学。
酶
基本要素
目的基因 载体基因 宿主
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重组DNA技术中常用的工具酶-限制性核酸内切酶
定义 限制性核酸内切酶(restriction 围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G + GATCC CCTAG G
endonuclease,
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周
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命名
Hin dⅢ
髓细胞白血病
Inv(16):CBF - MYH11 t(8;22): AML - ETO t(9;22): BCR - ABL
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表观遗传学

1. 概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的
Hale Waihona Puke 表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。

2. 特征: (1)可遗传；(2) 可逆性；(3) DNA不变 3. 表观遗传学的现象：
Xma I (2820) Sma I (2822) Eco RI (2881)
Kan
Xho I (2567)
T7 terminator
2-micron ori
URA3 f1 ori
Amp+
T ADH1
Pac I (2185) Xho I (2195)
pUC ori T CYC1
Nhe I (9811)

(1) DNA甲基化 (2) 组蛋白修饰
(3) MicroRNA
(4) Genomic imprinting (5) 端粒酶
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表观遗传学——甲基化
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表观遗传学——组蛋白修饰
组蛋白（去）乙酰化 De/Acetylation 组蛋白甲基化 Methylation 组蛋白磷酸化 Phosphorylation 组蛋白泛素化 Ubiquitination
pESC-Ura
13413 bp
Fibrinogen Gamma Chain
哺乳细胞 表达系统
MFa
Kpn I (3702)
GPD Fibrinogen alpha chain MF alpha
Hin dIII (7711)
T CYC1
Spe I (4695) Bam HI (5284)
GPD
Bam HI (7029)
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基因重组—转化

转化： 由外来 DNA引 起生物 类型改 变的过 程称为 转化。
细菌的转化
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基因重组—转化

病毒癌基因 感染宿主细 胞后，可整 合到宿主染 色体上，从 而使宿主细 胞癌变。
转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体 内的过程。
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基因重组—转导


溶原菌中 DNA可以原样地切离出来， 也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走 一部分。后者称转导。 带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。 来源于宿主的基因称转导基因。
组蛋白糖基化 ADP-Rybosilation
组蛋白与Swi/Snf复合体的结合 Swi/Snf complex, which, in vitro, uses the energy of ATP hydrolysis to disrupt histone-DNA interactions 多数化学修饰的化学基团可以减少组蛋白的正电性，从而使其与 DNA结合变疏松，使染色质结构发生变化。
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目的基因
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第22章）
Fibrinogen Beta Chain MFa
Eco RI (6348)
6104 bp
Bax-ZF5 VP16
Xma I (1623) Sma I (1625)
RSF ori
CK-B
大肠杆菌 表达系统
Hin dIII (1741)
SV40 pA
Bst BI (3623) Pst I (3593) Bam HI (3583)
BGH reverse primer BGH pA f1 origin SV40 early promoter sGFP
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质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某 些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
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载体
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA