空上有序和协同作用

新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网
络协同作用实现

细胞信号转导及病原体感染和免疫反应
1．酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system）

1989年Field 和Song等人在酵母细胞中 设计的分析蛋白质相互作用的方法。

以真核细胞转录激活因子的结构和活性 特点为基础的。
近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白
质组图谱。
二、蛋白质组学的产生与发展
背景

基因组时代 →后基因组时代 研究重点的转移及其标志
功能基因组学的主要任务

mRNA水平的基因表达研究取得进 展，但mRNA与蛋白质间的相关系 数仅为0.4～0.5

蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA
水平得到解答
进 展

鉴定和注释蛋白质的路线

通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹 配

通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或 氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配
目录
仪 器

MALDI-TOF质谱仪：灵敏度高
（可达fmol），分析速度快，
谱图简单易于解析以及受缓冲液、 盐份的干扰小
肽质谱指纹图在数据库中匹配 不成功的可能原因

样品量太少，PMF图信噪比太低，输 入库中搜寻的数据质量不好。 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单 一蛋白质，所获PMF图实际上是两个 以上蛋白质的混合图。

续：




操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据 库中未有记载 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶 解片段多 未知的新蛋白质 数据库规模太小
蛋白质组是：

对应于基因组的所有蛋白质构成的整 体，不是局限于一个或几个蛋白质。

同一基因组在不同细胞、不同组织中 的表达情况各不相同 。
在空间和时间上动态变化着的整体。

蛋白质组学(proteomics)
指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门
新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞
内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与
激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM) 可直接在显微镜下从组织切片 中精确分离特定的细胞或细胞群。
（二）蛋白质组研究中的样品分离

双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋 白质的等电点和分子量，结合凝胶化 学特性，分离各种蛋白质的方法。

传统O’Farrell系统双向电泳的缺陷。 Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯 度等电聚焦技术，GÖrg等成功地将 之应用于双向电泳。 优点
固相pH梯度等电聚焦的优点
克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 稳定的可以随意精确设定的pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮
分析，大大提高了分辨率及重复性。
毛细管电泳
capillary electrophoresis，CE

液质联用技术（LC-MS/MS）
蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以 代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽 段分子量，再通过串联MS技术，得到部分 序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定 蛋白质。

多维色谱技术（LC/LC-MS/MS） 根据蛋白质带电性及疏水性不同， 用MS分离多肽复合物。
（五）定量蛋白质组学研究
概念：把一个基因组表达的全部 蛋白质或一个复杂体系中所有的
蛋白质进行精确的定量和鉴定。
蛋白质定量的难点
低丰度蛋白质检测困难 蛋白质表达量差异很小，如在50% 以下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化
1．基于双向凝胶电泳的定量 蛋白质组研究策略
双向凝胶电泳(2-DE)是目前唯一能分离展 示大量蛋白质并进行蛋白质定量分析的一种 方法。 荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE）

功能蛋白质组学 (functional proteomics)的提出

功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某
一生理现象相关的所有蛋白质。

介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研 究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质 组学之间。

从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚
群体。

将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接
2003成立了中国人类蛋白质组组 织（CHHUPO），并分别于2003年9 月、2004年8月以及2005年8月召开 了中国蛋白质组学首届、第二届及第三 届学术大会，2004年10月在中国北京 召开了第三届国际蛋白质组学会议。
科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”
计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基

样品预分级的主要方法
蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性 蛋白等



蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等
蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基 体、叶绿体等
样品预分级主要作用在于 提高低丰度蛋白质的上样量和 检测灵敏度。
组织水平上的蛋白质组样品制备
临床样本都是各种细胞或组织 混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌 变的上皮类细胞总是与血管、基质 细胞等混杂。
第九章 蛋白质组学的研究方法和进展
背 景
基因数量有限性和基因结构的相对稳定性
vs 生命现象的复杂性和多变性
从genomic到proteome

对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系
和生物学功能进行全面深入的研究已成为
生命科学研究的迫切需要和重要任务。
主要内容
第一节 蛋白质组学的概念及其发展史 第二节 蛋白质组学研究方法概述 第三节 蛋白质组学在疾病研究中的应用
主要任务。
一、蛋白质组表达模式的 研究方法
蛋白质组表达模式 （expression profile）：

研究蛋白质组的组成成分 支撑技术主要有双向凝胶电泳、 以质谱为代表的蛋白质鉴定技术
及生物信息学分析。
（一）蛋白质组研究中的样品制备

通常可采用细胞或组织中的全蛋白 质组分进行蛋白质组分析。 也可以进行样品预分级，即将细胞 或组织中的全体蛋白质分成不同部 分，分别进行研究。

多维蛋白质鉴定技术 (multidimensional protein identification technology)
（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定
传统方法：蛋白质微量测序
氨基酸组成分析
新型蛋白质鉴定技术 —— 质谱（MS）法
基本原理：样品分子离子化后， 根据离子间质荷比（m/z）的差 异来分离并确定样品的分子量。
蛋白质组数据库是蛋白质组 研究水平的标志和基础

瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最 大、种类最多的蛋白质组数据库。 目前应用最普遍的数据库是NRDB 和 dbEST数据库。

dbEST数据库
由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和 欧洲生物信息学研究所（EBI）共同编辑， 包括许多生物体的表达序列标签（EST） 肽序列标签(PST)或部分序列信 息最适合查寻
金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。
我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组
研究方面取得了较大的进展。
第二节
蛋白质组学研究方法概述
蛋白质组研究更为复杂和困难：
蛋白质数目大大超过基因数目。
蛋白质随时间和空间而变化。
当前主要任务
发展高通量、高灵敏度、高准 确性的研究技术平台是现在乃至相
当一段时间内蛋白质组学研究中的
修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联 系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。
主要研究内容
了解某种特定的细胞、组 织或器官制造的蛋白质种类； 明确各种蛋白质分子是如 何形成类似于电路的网络的； 描绘蛋白质的精确三维结构，揭 示其结构上的关键部位，如与药物结 合并且决定其活性的部位。
研究对象 基础技术 研究层次
2．基于生物质谱的定量蛋白 质组研究策略
原理：对于具有相同离子化能力的蛋 白质或多肽，可以通过比较质谱峰的 强度（或峰面积）得到待比较蛋白质 的相对量。
二、蛋白质组功能模式的 研究方法
主要研究目标

揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互
协调的关系，并深入了解蛋白质的结构
与功能的相互关系，以及基因结构与蛋
“软电离”的特点

分子电离时保留整个分子的完整性，不 会形成碎片离子。 灵敏度高、快速、能同时提供样品的精 确分子量和结构信息、既可定性又可定 量、并能有效地与各种色谱联用来分析 复杂体系。

主要质谱类型

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 （matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）
Celera公司投资上亿美元独自启动了全 面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体 液中的蛋白质及其异构体，构建新一代 的蛋白质表达数据库的工作。
1997年召开了第一次国际“蛋白质组学” 会议 1998年在美国旧金山召开了第二届国际 蛋白质组学会议 1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白
质组会议
我国也于1998年启动了蛋白质组学研 究，在中科院上海生物化学研究所举办 了两次全国性的蛋白质组学研讨会
转录激活因Leabharlann GAL4的特点N端含NLS和与酵母GAL1基因启动子上游 激活序列(UASG)结合的结构域

C端含GAL1转录激活结构域