经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了 可以定向改造生物的新技术——重组DNA技术
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DNA重组
DNA重组即基因重组，是将不同来源的 DNA分子通过磷酸二酯键连接而形成新的 DNA分子的过程。
DNA克隆
DNA分子通过体外无性增殖获得的大量拷 贝
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重组DNA技术：在体外对DNA分子按照人工“剪切” 和“拼接”，将重组分子导入受体细胞进行无性繁殖，
第十七章 重组DNA技术
Genetic Engineering
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基因决定性状（一）
青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素
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基因决定性状（二）
❖ 家蚕能够吐出蚕丝为人类利用
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定向基因改造设想
设想 一
设想 二
设想 三
能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？
能否让细菌“吐出”蚕丝？
能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等 珍贵的药物？
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载体pBR322的结构图
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
SalI
pBR322
(4.36 kb)
ori
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pUC系列
（1）来自pBR322，分子量为2.7KB，含复制起点 （2）含氨苄青霉素抗性基因，且无克隆位点 （3）含标记基因LacZ，编码β-半乳糖苷酶N端146个
氨基酸 （4）多克隆位点位于LacZ内
11
限制酶的识别和切割位点
1）识别４-8bp 2）对称性—回文序列
EcoR I
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末端种类
１）３’-粘性末端 Pst I
２）５’-粘性末端
EcoRI
３） 平端 SmaI
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限制酶的应用
1. DNA重组 2. 限制酶（物理）图谱绘制 3. 突变分析（RFLP分析）、同源性分析 4. DNA测序
pU C 19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
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第二节 重组DNA技术的基本原理
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基本操作
获取-切割-连接-转化-筛选
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一 获取目的基链 反应（PCR） 合成
DNA模板 引物 dNTP Taq DNA聚合酶
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二、载 体
概念 能在连接酶作用下和外源DNA片段 连接, 实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的DNA分子。
类型 质粒 噬菌体 病毒
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载体分类
克隆载体 用于克隆和扩增目的基因的载体
基本特点: 1、复制起点 2、克隆位点（多克隆位点），供外源DNA插入 3、选择标记基因，以指示载体或重组DNA分子
移植
13
遗传疾病
11
糖尿病及并发症
7
眼病
3
骨质疏松
2
肿瘤疾病
175
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生物技术与传统中药
中药现代化——核心是建立与现代基因学说相应的现代中药理论 现代中药理论的建立——确立中药与基因表达的关系
中药药靶（基因）或作用位点基因的寻找 中药化学组：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分 中药临床药效的科学评价与分析方法 生物技术的应用 中药基因组——利用现代生物技术研究分析中药对人体（细胞）基因 表达（蛋白质）的影响。 技术平台：大规模基因表达分析（基因芯 片、SAGE、蛋白质组等技术）以及相关信息数据库的建立 中药化学组——利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药物代谢、 动力学。 技术平台：色谱及色谱-质谱，色谱-波谱，波谱-波谱联用 等分析技术与层析、临界萃取等分离技术 中药新剂型
获得大量DNA分子复制，并使受体细胞获得新的遗传特 征的过程，又称基因工程、分子克隆。
DNA重组技术别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果
分子克隆或基因工程 生物体外 基因
DNA分子水平 剪切→拼接→导入→表达
人类需要的基因产物
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7
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其它工具酶
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一、 限制性核酸内切酶
1. 分布：主要由细菌产生 2. 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列， 切割特定切点 3. 结果：产生具黏性未端（碱基互补配 对）、平端的DNA片段
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22Байду номын сангаас
pUC18和pUC19载体
pU C 18
H in d II I S p h I P stI S a lI X b a I B a m H I S m a I K p n I S a c I E c o R I
E c o R I S a c I K p n I S m a I B a m H I X b a I S a lI P stI S p h I H in d I II
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4. 核酸分子杂交分析
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美国生物制药产品种类及数量
（PHRAM）
疾病种类 产品数量
疾病种类
产品数量
感染性疾病
39
神经系统疾病
28
艾滋病及相关疾病 19
皮肤病
19
消化系统疾病
11
血液疾病
9
不育症
5
生长发育不良症
3
妊娠预防
2
心脏病
26
呼吸系统疾病
22
自主免疫系统疾病 19
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限制酶的分类
1. I型：具有限制和DNA修饰作用，在识别位点约
1000bp处切割DNA，位点不确定
2. II型：基因工程中的常用限制酶，能在DNA分子内
部的特异位点识别和切割双链DNA，切割位点的序列 可知、固定
3. III型：具有限制和修饰活性，能在识别位点附近切
割DNA，切割位点不确定
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是否进入宿主细胞 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数 5、易导入受体细胞
注：前三个特点必不可少
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表达载体 用于表达外源基因，合成目的蛋白的载体
除具有克隆载体基本原件外，还应具备表达元件
原核：启动子－核糖体结合位点－转录终止信号 真核：增强子－启动子－终止信号－ＰolyＡ信号
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17
质粒载体
(一)质粒 质粒的特点 举例
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18
质粒
概念 游离于细菌染色体外，能自主复制的闭环双链DNA
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19
pBR322载体
特点： 1、分子量较小，为4361bp，可容纳的外源DNA较
大 2、一个复制起点，具氨苄青霉素抗性（ampR)和
四环素抗性基因(tetR) 3、克隆位点位于氨苄青霉素抗性（ampR)或四环
素抗性基因(tetR)内，插入外源基因后可导 致相应基因失活
⑷ 人工合成
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二 目的基因和载体连接
1.平端连接
T4 连接酶 2.互补黏端连接
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29
3. 加同聚物尾连接
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30
4. 加人工接头连接
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三 重组DNA导入宿主细胞
重组DNA导入宿主细胞的过程称转化
细胞类型： 原核细胞 真核细胞
大肠杆菌 链球菌 枯草杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞
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四 筛选和鉴定重组DNA
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
1. 平板筛选 插入失活
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
无菌落
筛选重组子
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
阳性菌落
Ampr Tcs
提 取 DNA 电泳
重 组 DNA
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2. 酶切鉴定 3.PCR分析