2017年样品检测组操作技能培训
（一）高效液相基础知识
高志国
（2017.03.29）
高效液相色谱基础知识
色谱法原理与分类
HPLC的组成
HPLC的应用 HPLC色谱图名词术语 HPLC定量分析原理
色谱法原理及分类

什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
色谱法(Chromatography)溯源
100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特)分离植物色 素时采用的实验方法 他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直 立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中 各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带 Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的 实验方法，即现在的 Chromatography(色谱法)
适用：高沸点、热不稳定有机及生化 试样的高效分离
液相色谱法的分类
按流动相和固定相的相对极性分:
正相色谱(Normal Phase Chromatography)
o 固定相的极性大于流动相 反相色谱(Reversed Phase Chromatography) o 固定相的极性小于流动相 有机化合物的极性
分子间作用力(静电引力,偶分子间作用力(静电引力,偶极力,色散 力,氢键力)综合表现的一种表述
有机化合物极性示例
液相色谱法的分类
按分离过程的机理分:
1 吸附色谱(Absorption Chromatography)
根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离 2 分配色谱(Partition Chromatography) 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同 3 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography) 根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC) 4 体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography) GPC(Gel Permeation Chromatography) • 固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 GFC(Gel Filtration Chromatography) • 固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液
Tswett（茨维特)的实验
一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒
将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中
随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带 分离出不同的化合物 Chromato -- 颜色 Graphy -- 图象
色谱法原理
是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸 附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各 组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相 互分离 两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase) 有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相 又叫洗脱剂,溶剂
HPLC的组成
由五大部分组成：： 溶剂输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测系统（检测器等）
记录及数据处理系统
1. 高压输液泵
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体 的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速 是高效液相色谱的特点之一 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
安捷伦泵：小视频
色谱学堂：泵
在线脱气机
高效液相色谱仪流动相脱气的目的 1、使色谱泵输液均匀准确，减小脉动。 2、提高保留时间和色谱峰面积的重现性。 3、防止气泡引起尖峰。 4、使基线稳定，提高信噪比。 5、降低溶剂的紫外吸收本底。 6、减少死体积。 7、防止填料氧化。 视频 ：脱气目的 语,特指在某一系统中,具有相同成 分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相 之间有明显可分的界面
色谱分离原理
色谱法的分类
按流动相的物态分: 气相色谱 (Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱 (Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相(又叫洗脱剂)
色谱法的分类
按固定相的形态分: 平面色谱 o 纸色谱 o 薄层色谱 柱色谱
色谱法的分类示意图
什么是HPLC？
高效液相色谱法 –HPLC(High Performance Liquid Chromatography ) –是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的 高效能分离手段: o High 高 o Performance 性能 o Liquid 液体的 o Performance 色谱
高压输液泵： 恒压泵（流量随阻力变化重现性差）
恒流泵（多用）：往复式
注射式
作用：将流动相在高压下连续不断地送入液路系统。 性能：①有足够的压力 ②输出流量恒定，可调 ③输出压力平稳 ④泵室体积小 ⑤泵体抗腐蚀、耐酸
梯度洗脱装置
作用：将两种或两种以上溶剂按一定程序连续 改变配比，以改变流动相极性、离子强度、 PH值、提高分离效率。 低压梯度洗脱（常压混合，高压进柱， 1 个 泵。） 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱， 2 个 泵。）
2. 进样装置
进样视频：安捷伦 进样视频：岛津
3. 分离系统
包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm， 柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10 mm高效微 粒固定相。柱温一般为室温或接近室温
HPLC特点
特点：高压、高效、高速、高灵敏度 1. 高效分离 ： n =105 /米 2. 高速 ：使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟 3. 高灵敏度 ：检测下限：10-9-10-13g（最小检测量） 4. 自动化程度高：仪器分析、电脑控制、色谱工作站 5. 应用范围广 ：可测有机物75%-80%