菌种的传代、保藏及菌液制备
标准菌种的概念及其管理
§
§
检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中
菌种的名称
§
生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］§白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］
§
微生物菌种的使用、保存与管理、验证。
§一.制定菌种使用保藏管理程序
§
§
标准菌种的保藏形式
培养基的选择§
菌种的传代
§
§
§菌种的接种
菌种的复苏
《
的传代次数不得超过
从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种
后为第
严格控制菌种的传代
§
1.复溶菌种并转种按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）
2.鉴定菌种后制甘油冷冻管
后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管
面，工作用菌种（为第三代）
§3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验
§
保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）
§将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。
§当工作用用菌种代数小于
上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接
§转接第四代，直至四代转为五代。
菌种保藏标签的规范与要求
菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：
称，系列号
旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录。
严格菌种的质量控制，确保菌种的质量
菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。
因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对
菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。
菌种处理的注意事项与有关记录
§
都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于其他标准品的特殊要求。
1.
的危害程度，要实行严密安全的保藏管理。
2.
检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容
包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养特性、
和培养条件、保藏方法、储存条件及保存库址等。
§
4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处，其他部门的人员未经允许不得进微生物实验室。
所有的意外情况，都必须立即向主管部门报告以便得到及时解决。
5相关记录
中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录格式。
菌种的确认
一.初步鉴定试验
分离培养
革兰染色
生化试验
用及代谢产物，借以鉴别细菌的种类
二.全面鉴定
铜绿假单胞菌
§
芽胞、有荚膜、单端有1～3根鞭毛。
§培养特性：专性需氧，最适温度为
长是铜绿假单胞菌的一个特点。
营养无特殊要求，普通培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。
在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成菌膜。
§分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基
§生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉红色渐变为紫红色）
铜绿假单胞菌—琼脂平板的形态
铜绿假单胞菌—鞭毛染色形态
生孢梭菌
形态特征：G粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体
革兰染色为阴性
体，位于军体中央或近端，有周身
培养特性：专性厌氧，但要求不严格。
一般培养时不易形成芽孢，在普通营养琼脂培养基形成不规则菌落。
在硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、光滑、湿润、不透明的菌落。
在硫乙醇酸盐流体培养基
中常在其表面形成菌膜。
大肠埃希菌
§
运动。
有菌毛。
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落。
在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。
分离培养：伊红美兰培养基（
§生化反应：IMViC试验结果：＋＋－－
大肠埃希菌—EMB平板菌落形态
大肠埃希菌—显微镜下菌体形态
大肠埃希菌—电镜下菌体形态
金黄色葡萄球菌
§
列呈葡萄串样，无
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、隆起、边缘整齐、不透明的菌落。
菌落因种不同而出现不同的色素。
在营养肉汤培养基中呈均匀
混浊生长。
分离培养：高盐甘露醇培养基
生化反应：
金黄色葡萄球菌—显微镜下菌体形态
金黄色葡萄球菌—电镜下菌体形态
沙门菌
§
周身鞭毛，能运动。
有菌毛。
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐的菌落。
在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。
分离培养：沙门菌属志贺菌属琼脂
§分离培养：
基
生化反应：
沙门菌—SS平板菌落形态
沙门菌—显微镜下菌体形态
沙门菌—血清凝集试验结果
枯草芽孢杆菌
§
胞，位于菌体中心或次极端，不小于菌体。
培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。
在营养肉汤培养基中形成菌膜
§分离培养：营养琼脂平板
枯草芽孢杆—琼脂平板的形态
枯草芽孢杆—显微镜下菌体形态
真菌的初步鉴定试验
§
真菌的分离培养
⑴.
细菌菌落相似，但较大些，菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，有部分单细胞真菌可在培养基中形成假菌丝，此菌落称为类酵母型菌落。
⑵.
状、绒毛状、粉末状，并产生不同的色素。
快速显色鉴别培养法：经
果。
如白色念珠菌呈绿色或蓝绿色菌落，黑曲霉呈白色丝状菌落，里面呈淡粉红色，一周后逐渐变成黑色。
霉菌各种菌落形态
白色念珠菌
§
§
落。
培养稍久，菌落增大。
在改良马丁培养基中
白色念珠菌—显色平板的形态
白色念珠菌—显微镜下菌体形态
黑曲霉§
§
黑曲霉—显微镜下菌体形态
黑曲霉—电镜下菌体形态
菌种传代的工作环境、工具及其他器皿§
1
2
§
1
2
3
4
5、酒精灯及其他玻璃器械
菌种的接种操作步骤
一. 斜面接种法：
1.
2.
菌名及接种日期，和传代菌种一并移入接种室或
管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约
灼，往返通过三次。
4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种
环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后
上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。
取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。
将已接种好的细菌管置
箱培养
培养箱培养
直刺入，接近管底但不接触管底，然后接种针沿穿刺线原路退出。
三
界处的管壁上轻轻研磨，使菌混合于培养
液中。
黑曲霉接种方法：
§
环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯，拧开瓶盖，用无菌吸管吹吸管内液体，取
用吸管涂布均匀，置
态可参照下图。
如上图，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。
转种完毕的冻存管和使用过的器具应经
分钟再作处理。
菌种的保藏
菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。
一、菌种保藏的目的
性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不
被污染，以达到便于研究
二、菌种保藏的原理
§首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行§
§
三、菌种保藏方法
及性。