成是必需的。对营养缺陷型dhfr－ 细胞来说，二
氢叶酸还原酶基因可用作选择标记，在缺少胸腺
嘧啶和次黄嘌呤的选择培养基中筛选出转化了的
细胞。
选择标记之一
二氢叶酸还原酶基因
氨甲喋呤（ methotrexate, MTX ）和三甲氧 苄二氨嘧啶（ trimethoprim ）是二氢叶酸类似物，
是二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂，当培养基中
子量为 26,888Da ，其产生荧光的发色团是由 Ser65 ，
脱氢 Tyr66 ， Gly67 自身环化及氧化形成，形成时需
要氧，不需要酶催化。野生型 GFP 发射的荧光强度
较弱，人们通过突变来提高 GFP 的荧光强度，有实
验表明，当GFP S65T 的Ser65突变为Thr时，在转化
的BOSC23细胞中荧光强度比野生型增强18倍。
激光微束穿孔法
一定波长的激光束经聚焦后到达细胞表面时
其直径大约只有 0.5 ～ 0.7μ m ，这种直径很小但能
量很高的激光微束可引起膜的可逆性穿孔。具体 做法是：在荧光显微镜下找到适当的细胞，然后 用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束 脉冲，细胞壁被击穿， DNA 分子随之进入细胞。
由于激光孔径小，为线粒体、叶绿体的遗传工程
转化率。
高电压短时间举例：5 KV 180μS
低电压长时间举例：300V 10~20min
显微注射法
显微注射法（ microinjection ）采用显微操
作系统、毛细管注射。常用于动物受精卵细胞
的转化，也可用于植物原生质体的转化。此法
的关键是受体细胞的固定，受体细胞常被固定
在微吸管上，或固定在琼脂中。
含有MTX时，二氢叶酸不能转变成四氢叶酸而生 长受到抑制。有一种突变的DHFR，它不受MTX 的抑制，以它作选择标记，转化的细胞可在含 MTX的培养基上生长。
选择标记之二
胸苷激酶基因
tk－的宿主细胞在正常的培养基中可以生长，但 在含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸苷（T） 的培养基中不能生长。这是因为氨基喋呤抑制了二 氢叶酸还原酶的活性，导致细胞不能合成 TTP 。若 ＋ 将 tk 基因转入细胞内，在 HAT 培养基中培养，虽 然氨基喋呤抑制了核苷酸的从头合成途径，但培养 基中的次黄嘌呤可以通过补救途径转变成 ATP 和 GTP ，胸苷通过胸苷激酶的作用可以转变成 TTP （ CTP可以按正常途径合成），所以被 tk基因转化 了的细胞可以在HAT培养基中生长。
精氨酸、胭脂碱、章鱼碱三种物质的电泳迁移
率不同，精氨酸的最大，章鱼碱和胭脂碱的接近，
电泳 1 小时以上可将二者分开，章鱼碱的迁移率略 大于胭脂碱。 有时因细胞内缺乏冠瘿碱合成的底物，导致假 阴性结果。可在提取液中加入精氨酸，保温一段时 间后再检测冠瘿碱。
绿色荧光蛋白基因
绿 色 荧 光 蛋 白 （ green fluorescent protein ，
冠瘿碱合成酶基因
冠瘿碱合成酶是农杆菌Ti质粒上T-DNA区编码的 一类与冠瘿碱（如章鱼碱、胭脂碱、农杆碱、农瘿碱、 琥珀碱、甘露碱）合成有关的酶。从转化的细胞中提 取冠瘿碱，纸上电泳后用菲醌染色，紫外光下检测黄 色荧光，根据冠瘿碱的有无和多少，可知冠瘿碱合成 酶的表达情况。
报告基因之四
冠瘿碱的检测方法
二、DNA直接导入的
基因转化方法
1 聚乙二醇法 2 高压电穿孔法 3 显微注射法 4 基因枪法 6 脂质体介导法 7 激光微束穿孔法 8 超声波介导法 9 DEAE-葡聚糖法
5磷酸钙共沉淀法
10 原生质体融合法
聚乙二醇诱导基因转化
外源 DNA 加聚乙二醇（ polyethylene glycol ，
基因枪法
基因枪法（particle gun）是在钨或金颗粒 的表面吸附一层外源 DNA，用高压气体、电弧 放电蒸发液滴、火药爆炸等方法使加速颗粒射 出，可穿过植物细胞壁。该法的优点是操作迅 速、简单、金属微粒的喷射面广、转化频率高，
具有广泛的应用前景。
基因枪工作原理图
点火装置 高压放电 电极 水滴 载片 火药子弹 火药爆炸
选择标记之五
选择标记之六
抗除草剂基因
除草剂 PPT 是一种谷氨酸类似物，它竞争性 地抑制植物体内谷氨酰胺合成酶（GS）的活性。 谷氨酰胺合成酶催化下列反应，起到解氨毒的作 用。当PPT存在时，GS活性被抑制，细胞内NH4+ 积累，细胞中毒而死亡。
选择标记之六
抗除草剂基因
PPT 乙酰转移酶（ PAT ）可以催化乙酰 CoA 分
聚乙二醇诱导基因转化
受体细胞处于 M 期最好，因此时无核膜，
能提高转化率。加入运载体 DNA 也能够促进转 化，运载体 DNA 常用小牛胸腺 DNA 或鲑鱼精子 DNA，要求剪切成5～13kb大小。剪切可用注射 器来回吸注 DNA 溶液几次，然后通过电泳检测 剪切效果。
高压电穿孔法
在电击时加入PEG和运载体DNA可提高
PEG ）和二价阳离子（如 Mg2+ 、 Ca2+ 、 Mn2+ ）可 在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的 内吞作用导入细胞。用多聚赖氨酸或多聚鸟氨酸 代替 PEG 也行，二价阳离子常用 CaCl2 或 MgCl2 。
植物细胞必须除去细胞壁，可用纤维素酶降解细
胞壁，在等渗溶液中分离得到原生质体。
GFP）基因取自维多利亚水母Aequorea victoria，广
报告基因之五
泛应用于细菌、酵母、动物和植物中。GFP在受到
395nm 紫外光或 490nm 蓝光照射时，会发出 509nm 的绿色荧光。因为GFP不是酶，检测时不需要加底
物，且没有毒性，所以可以用于活体检测。
GFP的性质
GFP是由238个氨基酸残基组成的单体蛋白，分
农杆菌的瘤诱导
根癌农杆菌从植物的伤口处感染，使感染处产生
冠瘿瘤（ crown gall）；发根农杆菌也是从植物的伤
口处感染，使感染处产生茎瘿瘤（cane gall），瘤上
因调控和转化基因的表达情况。报告基因一般
是一种酶的基因，对报告基因的要求是在受体
细胞中没有其产物，产物容易检测。
β-葡糖醛酸糖苷酶基因
β-葡糖醛酸糖苷酶（ β-glucuronidase， GUS） 是目 前 应用 最 广泛 的 报告 基 因之 一 。它 以 x-gluc （ 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -β- 葡糖醛酸）为底物，催化产
塑料子弹
微粒
档板
靶组织
磷酸钙沉淀法
将外源DNA与CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液， 逐滴加入到不断搅拌的HEPES-磷酸钙溶液中，形 成 DNA －磷酸钙共沉淀复合物。然后用吸管将沉
淀复合物加到培养的哺乳动物单层细胞表面，细
胞可将复合物吸收到细胞内，保温几小时后，用
新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养液继续培养，
三、农杆菌作载体的 植物转基因方法
农 杆 菌 属 于 根 瘤 菌 科 土 壤 杆 菌 属 （ Agrobacterium ），常用的两种植物基因工程载
体农杆菌是根癌农杆菌（ A. tumefaciens ）和发根
农杆菌（A. rhizogenes），其中根癌农杆菌是植物
转基因工程中应用最广泛的载体系统。
报告基因之一
生蓝色的5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝沉淀，可用来观察
转化基因的组织化学定位。还可以4-MUG（4-甲基
伞形酮葡糖苷酸）为底物，催化产生4-甲基伞形酮，
产物用荧光分光光度计测定，此法可测定基因表达 的强度。
氯霉素乙酰基转移酶基因
CAT 也能用作报告基因。用 14C 标记的氯 霉素、乙酰 CoA 与细胞、组织提取物反应，薄 层层析法分离反应产物，放射自显影可测得 CAT活性。
选择标记之三
新霉素磷酸转移酶基因
新 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基 因 （ neomycin phosphotransferase Ⅱgene, nptⅡ）是一个来源于转座子Tn5 编码的分子量为 25KD的酶，它催化许多氨基糖苷类
抗生素（如新霉素、庆大霉素、卡那霉素、G-418）
的磷酸化反应，将 ATP上的 γ磷酸基团转移到抗生素 分子上，阻止了它们与靶位点 —— 核糖体的相互作 用，从而使这些抗生素失去对细胞的毒性。这类抗 生素的毒理作用是与叶绿体及线粒体核糖体的 30S亚
出哪些细胞被转化了，哪些细胞没有被转化。将一
个选择标记与外源目的基因连接，被转化的细胞就
带有选择标记。选择标记常用抗生素抗性基因，真
核生物细胞所用的抗生素与原核细胞有所不同。
选择标记之一
二氢叶酸还原酶基因
二 氢 叶 酸 还 原 酶 （ dihydrofolate reductase,
DHFR ）对于真核细胞核苷酸（胸腺嘧啶）的合
基结合，阻止70S核糖体形成。
潮霉素磷酸转移酶基因
潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase，HPT）可使潮霉素B磷酸化而失去 毒性。潮霉素 B 可抑制核糖体的功能，使细胞 不能合成蛋白质，因此对大多数植物和动物细 胞因
氯霉素能抑制真核细胞线粒体中的蛋白 质 合 成 ， 而 氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 （chloramphenicol acetyltransferase，CAT） 能使氯霉素乙酰化，从而失去毒性。
绿色荧光蛋白
The Nobel Prize in Chemistry 2008
“for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP”
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien 钱永健
子上的乙酰基转移到 PPT 分子的游离氨基上，乙酰 化了的PPT失去对GS的抑制作用，从而使转化了pat 基因的植物表现出对PPT的抗性。 用硅胶G 薄层层析可以分离和分析乙酰化的 PPT ，