蛋白的提取和定量
肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。

裂解液分装后保存于-70℃
蛋白质定量：BCA蛋白测定法
①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

BCA工作液室温24小时内稳定。

②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。

③将标准品按0，2，5，10，15，20，25 ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品的
④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。

⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。

同时打开酶标仪预热。

注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。

BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。

并且显色反应会因温度升高而加快。

如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。

⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）：
总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul）
RSB=1/5*总体积（ul）
TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul）
先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。

最后放于-70℃保存。

Western Blot
SDS-PAGE
1. 玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。

灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。

状况好时往往能观察到
水与胶的界限。

4. 分离胶凝固后，配制浓缩胶。

将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。

在此期间，打开水浴锅（100℃）
注：此步后可停止，将胶连同梳子放入4℃保存一夜，若保存时间较长，为防止水分流失，可加盖湿润的滤纸和保鲜膜。

5．电泳前准备好：待测蛋白、Marker、1＊running buffer。

蛋白在沸水中煮3－5min。

（第二次后不用煮沸）
6．拔梳子，立即用1＊running buffer冲洗孔道（用塑料吸管）。

7．将玻璃板取出，固定于电泳槽（短面冲里－相对），也要牢固，可先将电泳液倒入两玻璃板槽间观察是否渗漏。

注：标记号1、2板及左右。

8．固定好后，加样。

跑道号码加入物质及体积
1 3.5ul Marker (thermo #26616)
2-10 10ul Sample
9．玻璃电泳槽倒满1＊running buffer，电泳液没过电泳槽中的钢丝即可，注意标记好带的顺序。

10.电极
黑对黑红对红，电压100V电泳1－1.5h，等蓝色条带跑出后再等待10－15min。

蓝带对应8KD蛋白，根据蛋白样品分子量决定具体的电泳时间，确保不让目标蛋白抛出凝胶。

一般可等蓝带完全跑出凝胶后10多分钟停止电泳。

Western-ECL
一、转膜
1. 玻璃板取出，用跷胶片打开，标记好切胶位置，将浓缩胶和分离胶上的空白切掉。

切胶时不要划，要切。

注意，在右上角切口标记，量胶的长、宽。

2. 将切好的胶（粘在一片玻璃板上）浸入Transbuffer，晃动使胶脱离下来，放上摇床，中速30min。

3. 根据胶的长宽剪滤纸和PVDF膜（不能折，不能用手碰），PVDF膜的右上角与胶一样切口。

滤纸不能太大，膜可以大一点。

PVDF膜甲醇激活，transbuffer 摇床10min。

将滤纸浸入Transbuffer。

（Transbuffer不倒掉）
4. 转膜装置:
①滤纸可以采用学校的大张滤纸剪裁，四层叠在一起使用
②三明治由低层向高层为：四层滤纸――膜――胶――四层滤纸，大小要一致
③滤纸、膜、胶都需要用TRANS BUFFER浸透，上面滴加TRANS BUFFER
④ 100伏转印60分钟。

⑤如果转膜结束后不立即做，可以用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗，
晾干，保鲜膜包好后置四度保存。

再用之前，甲醇激活，再用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗。

即可封闭
二、杂交
1. 将10*TBS稀释至1*（100ml→1000ml），加入1ml Tween 20（0.1％），即TBST。

（Tween较粘稠，把枪头剪掉一块。

）
2．配封闭液，脱脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足够（2.5g脱脂奶粉，TBST50ml。

）
3.将PVDF膜用PBST洗一下，根据Marker分子量切带（在右上角切口标记,
一定要在平的地方切）。

* 若此时停止当日试验，可将NC膜放在保鲜膜上晾干，包好放入冰箱4℃。

待使用时，用PBST洗一下，放入封闭液。

4．正面朝上放入脱脂奶粉中封闭1h，放在摇床上。

配杂交液：用小瓶称0.2g BSA，用量筒加入PBST20ml。

5．杂交完毕后，用TBST略洗一下膜，加入杂交液将小条没过（3ml即可，可视情况而定）
6．加入一抗，摇床2h。

过夜。

7．取出膜，用洗膜液洗3次，5－15min／次。

计算杂交液体积，若不足再配。

8.洗完三次膜加入二抗，摇床1h
9.用洗膜液洗3次，5－15min／次。

三、发光反应
准备：发光板、滤纸、小镊子、1000μl加样器、发光液1，2（按1：1的量混合先白瓶后黑瓶，混匀，注意换枪头）EP管。

显影：将洗完的PVDF膜放入PBST保持膜湿润，排好条带，记住顺序，用滤纸略吸水，放在发光板上，滴加显影液，用枪头滴在PVDF膜上，等20－30s，发光。

存盘。

发光后，如要回收条带，收回后蒸馏水洗净，加入一抗二抗清除液，没过条带，摇床10min,蒸馏水漂洗5min,三次。

洗净晾干回收。

下次再用继续封闭。

备注：
1. 10×TBS
0.2M Tris base (FW121.14) 12.114g
1.5M Nacl (FW58.44) 43.83g
H2O to 500ml
PH=7.2—7.4 with HCL
TBST 1× TWEEN20 TO 0.05﹪
1L 100ml 10× and 500ul TWEEN20
2. RIPA buffer100ml 可订购
Tris 0.607g 溶于90ml水，HCl调PH=7.5，补足到100ml
NaCl 0.8766g
NP40 1ml，
脱氧胆酸0.5g，
SDS 0.1g，
用时按1：1000加入PMSF
每10ml放入一片PhosSTOP
3. PMSF贮备液
配置0.1M储存液，分子量174.19
0.0174g溶于为1ml无水乙醇（或异丙醇），-20摄氏度保存，用时1：1000稀释；
4. 5*RSB10ml PH=6.8
Tris-HCl PH 6.8 0.312M/L 3.12mM*121.14=0.3779gTris
SDS 10% 1g
β-巯基乙醇25% 2.5ml
溴酚兰0.25% 0.025g
甘油50% 5ml
5. 凝胶储备液（30％Acr／Bise）可订购
acrylamide(丙烯酰胺，有剧毒) 29g
N’,N’-Methylenebisa-crylamide 1g，
加ddH2O至100ml。

6. Gel buffer
分离胶：1.5M Tris—HCl PH: 8.8
浓缩胶：0.5M Tris—HCl PH: 6.8
方法：按照Tris的摩尔质量计算所需摩尔浓度（Tris摩尔质量：121.14）
故分别称取Tris 18.171g、6.057g，加蒸馏水90－95ml，然后用PH
计调节溶液PH,最后定容至100ml。

7. 10%SDS
1g SDS加入蒸馏水10ml
8. 10﹪APS
0.1g过硫酸铵加ddH2O至1ml，新鲜配制
9. 10*电泳缓冲液（running buffer）
Tris 30.3g，
甘氨酸144g，
SDS 10g，
蒸馏水定容至1000ml。

（PH = 8.3）
10.Transbuffer:
Tris 3.03g，
甘氨酸14.4g，加水至850ml，再加甲醇150ml
11.封闭液：脱脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足够（2.5g脱脂奶粉，TBST50ml）
12.洗膜液：0.1﹪Tween20,1×TBS
13.杂交液：1﹪BSA,0.1﹪Tween20,1×TBS 几十毫克几毫升！
14.显影液、定影液
15. 5*PBS
NaH2PO4 ·2H2O 1.362g 8.5m mol
Na2HPO4 ·12H2O 16.295g 45.5m mol
NaCl 43.83g 0.75mol
上述药品定容至1000ml。