WTLOST动物固体组织蛋白提取 Protocol1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入 75%乙醇中浸泡。

早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。

2、 裂解液配制：RIPA ：PMSF=100：1，现配现用。

（1000ulRIPA+10ulPMSF ）。

置入 4℃冰上。

3、抽蛋白（应冰上进行）：a 、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。

一般 10ml 管体系中加入：7-8 粒磁珠、100mg 组织、1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。

b 、匀浆。

手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块， 一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎， 也可用国产超声波发生仪，用 40 安培，5 秒/次，间隙 10 秒反复 3～5 次。

反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右），但有部分酶活力会受影响。

c 、将组织匀浆转入 1.5ml 的 EP 管中（eppendorf 管、离心管）。

12000r/min 4°C 离心 15min 。

d 、离心后 EP 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的 EP 管中。

可-80℃保存。

4、蛋白浓度测定。

a 、配工作液：溶液 A ：溶液 B=50：1（200ul ：4ul ）。

需测试复孔。

标本 X ，则需 A 量=2*；B=2*（X+1+1）*4。

c 、复孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlEP 管，再加入 54ulH 2O ，混匀。

即 10 倍稀释。

d 、取 20-25ul 10 倍稀释蛋白样本加入 96 孔板平底板内，再加入 200ulAB 工作液，混匀振荡后，37℃ incubate 30min 。

注：应现加蛋白样本，再加工作液。

因为每次加蛋白后需换 tip ，再加入工作液即起反应，应缩短时间。

e 、酶标仪检测 562nm 吸光度。

Program f 、计算蛋白浓度。

根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中 Y ：蛋白浓度；X ：吸光度。

最终蛋白浓度为：10*Y （ug/ul 、mg/ml ） g 、蛋白样本放-80℃冻存。

大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。

在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化， 这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。

博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。

如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。

当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。

Commassie 法（Bradford 法）：原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料 G-250 结合，颜色从棕色变为蓝色，在 595nm 处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。

BCA 法：原理：在碱性条件下，蛋白将 Cu++还原为 Cu+，Cu+与 BCA 试剂形成紫色络合物，测定其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

现对这两种方法进行比较： 一、实验材料：细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）M231B CA 蛋白定量试剂盒（AR0146）Commassie 改良增强型蛋白质定量试剂盒（AR0145）二、操作步骤：Commassie 法：1. 将BSA 冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或PBS 稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml 八个浓度的蛋白标准溶液。

2. M231 用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

3. 各取20ul 蛋白标准品和待测M231 样品至相应标记的微孔板中。

4. 滴加200ul 考马斯增强型试剂（溶液A）至每孔混匀并充分震荡30S5. 停止震荡，在室温孵育样品10min6. 在酶标仪中测量595nm 时的吸光值。

7. 绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

BCA 法：1. 按50 体积BCA 试剂A 加入1 倍体积BCA 试剂B 配置适量BCA 工作液，充分混匀。

2. 将BSA 冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或PBS 稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml 八个浓度的蛋白标准溶液。

3. M231 用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

4. 各取20ul 蛋白标准品和待测M231 样品至相应标记的微孔板中。

5. 滴加200ulBCA 工作液至每孔混匀并充分震荡30S6. 停止震荡，在37 度孵育样品30min7. 在酶标仪中测量562nm 时的吸光值。

8. 绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

三、实验结果1234567Commsie法吸光值0.530.5220.4310.2620.1180.0410.001BCA 法吸光值0.8120.4440.2570.140.060.0370.017其中1 到8 为2000ug/ml，1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 的标准浓度的BSA 蛋白，9 为空白孔，样品1为8 倍稀释M231 总蛋白，样品2 为32 倍稀释M231 总蛋白Commassie 法：为了测试准确，应在试剂加入后的5～20min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.4mg/mlCommassie 法优点是：1. 灵敏度高，据估计比Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1ug。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大的多。

2. 测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5 分钟左右。

由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2 分钟即可完成，其颜色可以在1 小时内保持稳定，且在5 分钟至20 分钟之间，颜色的稳定性最好。

3. 干扰物质少。

如干扰Lowry 法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M 的NaOH。

（如同0.1M 的酸干扰Lowary 法一样）。

3. 标准曲线也有轻微的非线性，在0-1000ug/ml 浓度范围内有较好线性。

因而不能用Beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

BCA 法：由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28mg/mlBCA 法特点：1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。

2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。

3. 在20-2000μg/ml 浓度范围内有良好的线性关系。

4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA 小于10mM。

DTT 小于1mM 巯基乙醇低于1mMBCA 法和Commassie 法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。

（Radio Immunoprecipitation Assay）RIPA 裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。

RIPA 裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP 等。

RIPA 使用方法对于培养细胞样品：1.融解RIPA 裂解液，混匀。

取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。

2.对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。

按照6 孔板每孔加入150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。

用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。

通常裂解液接触细胞1-2 秒后，细胞就会被裂解。

对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。

按照6 孔板每孔细胞加入150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。

再用手指轻弹以充分裂解细胞。

充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

如果细胞量较多，必需分装成50-100 万细胞/管，然后再裂解。

裂解液用量说明：通常6 孔板每孔细胞加入150 微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200 微升或250 微升。

对于组织样品：1.把组织剪切成细小的碎片。

2.融解RIPA 裂解液，混匀。

取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。

3.按照每20 毫克组织加入150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。

(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

)4.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

5.充分裂解后，10000-14000g 离心3-5 分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western 和免疫沉淀等操作。

6.如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex 使样品裂解充分。

然后同样离心取上清，用于后续实验。

直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。