氨基酸分析技术的应用与实践中国农科院饲料研究所刘庆生2005年6月28日氨基酸测定方法的基本框架¬氨基酸总量的测定(十八种氨基酸)常规酸水解氨基酸氧化酸水解测含硫氨基酸碱解测色氨酸¬游离氨基酸的测定添加氨基酸测定生物材料中的游离氨基酸测定蛋白水解氨基酸总量的测定¬常规酸水解—测定除色氨酸、含硫氨基酸以外的蛋白水解氨基酸（15种）¬氧化酸解用HBr做终止剂—可测定除色氨酸、酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸以外的蛋白水解氨基酸（14种）用偏重亚硫酸钠做终止剂—可测定除色氨酸、酪氨酸以外的蛋白水解氨基酸（16种）¬碱解测定色氨酸常规酸水解¬原理: 蛋白质是氨基酸以α-氨基和α-羧基形成酰胺键，共价地结合形成的多聚物。
因此测定氨基酸必须先水解，将氨基酸间的肽键打开，然后才能分离、测定。
该法可测定15种氨基酸，但含硫氨基酸（主要是胱、半胱和蛋氨酸）水解中会被氧化，生成多级氧化产物，难以测准，色氨酸则全部分解为NH3和CO2，而无法测定。
¬基本程序¬过程控制基本程序混匀,离心或过滤取上清液, 测定过程控制（1）¬酸解法（常规酸解与氧化酸解-酸解）¬样品粒度与称样量样品均一性谷物氨基酸测定标准：60目筛，30mg饲料氨基酸测定标准：40目筛，100mg ¬氨基酸标准的0.3-2倍（预先测定粗蛋白含量）。
¬对于粗脂肪含量≥5%的样品需先脱脂。
过程控制（2）酸解剂(浓度，添加苯酚）酸样比（可在40倍范围内变化）欧洲：10mgN：20/500ml北美：10mg蛋白：2/40ml 水解方式：真空（充N）封管/回流水解水解温度与时间110℃-22h，135 ℃-4h，165 ℃-1h去酸方式氧化酸解¬原理:样品用过甲酸处理使蛋白质中的胱氨酸和蛋氨酸分别氧化为磺基丙氨酸和蛋氨酸砜, 然后酸解,打开肽键形成单一氨基酸的混合液, 用色谱分离、测定。
¬基本程序¬过程控制基本程序过程控制¬过甲酸用量10mg N：0.3-33ml；7.5-25mg N：2-10ml ¬冷氧化(0℃-16h)与热氧化(55℃-15min)¬不同终止剂HBr: Trp、Tyr、His 、Phe偏重亚硫酸钠：Trp、Tyr¬酸解方式¬蒸干与调pH¬根据需要选择方法¬高盐样品（NaCL含量≥3％，3mg/mL AgNO3）色氨酸的测定¬基本程序50～100mg 样品置聚四氟乙烯管中110±1℃水解20h＋1.5mL 4mol/L LiOH , 液N 2冷冻,抽真空至≤7Pa(或充N 2), 封管冷却开管转移至25mL调pH 至约4, 用水定容离心或过滤,上机过程控制¬碱解剂NaOH、LiOH、Ba(OH)2 KOH¬水解时间¬是否用内标¬不同测定方法比色法离子交换色谱HPLC—UV 、Fluro游离氨基酸的测定¬饲料、食品中添加的游离合成氨基酸的测定¬氨基酸肥料当中的游离氨基酸的测定¬生物材料中游离氨基酸的测定动、植物组织中的游离氨基酸的测定--提取与除去蛋白生理体液中游离氨基酸—沉淀蛋白尿中的游离氨基酸游离氨基酸的测定当中的问题¬这些样品无需水解，但必须从固体样品中完全提取出来¬除去干扰测定的其他物质（蛋白、金属离子）去除蛋白方法：化学沉淀法、高速离心法、超滤法和离子交换法去除金属离子方法：化学沉淀法（EDTA）蛋白沉淀剂的选择¬蛋白沉淀剂的选择：应用较多的有苦味酸、磺基水杨酸（SAA）、三氯乙酸、乙醇等，Ohara曾比较上述沉淀剂和丙酮、硫酸锌、氢氧化钡、钨酸钠等九种沉淀剂的测定效果，证明苦味酸、SAA和乙醇效果最好。
随着柱前衍生HPLC法的应用，甲、乙醇沉淀、高速离心和超滤法以及这些方法的结合日趋广泛：Davey等用PITC/HPLC测定生理体液，认为血浆、羊水用乙腈做沉淀剂最适宜，脑脊髓液用超滤法最佳。
农业研究中，植物的根、茎、籽实、浆液常用80%的乙醇沉淀蛋白。
游离氨基酸的提取¬用0.02mol/L浓度的酸反复提取，然后过滤或离心，汇集上清至预定体积；¬用0.1mol/L浓度的酸提取一次，而后用水反复提取，汇集上清至预定体积，并使最终盐酸浓度达到约0.02mol/L。
实验证明后者优于前者。
添加的游离合成氨基酸的测定一般食品饲料中添加的合成氨基酸赖氨酸蛋氨酸苏氨酸色氨酸1～2g样品＋0.1mol/LHCl 30mL, 搅拌提取15min,用水定容,过滤, 无需去蛋白,可直接上机测定。
蛋白、脂肪含量高的样品仍需脱脂和沉淀蛋白含氨基酸叶面肥料当中的游离氨基酸的测定¬称取试样1-5g，置于250mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，取上层清液2mL，加入5%磺基水杨酸溶液2mL，混匀，放置1h，使蛋白质沉淀。
再加入1%EDTA溶液1mL和0.06mol/L盐酸溶液1mL，用离心机离心15min。
生物材料与液态食品中游离氨基酸的测定¬固体组织¬生理体液固体组织中游离氨基酸测定动物组织：2g+5倍体积的3%磺基水杨酸-高速组织捣碎机中捣碎-10000rpm离心15min-取上清液上机（1g+5mL柠檬酸缓冲液pH2.2-匀浆-18000~78000g离心或0.5g+3ml5%三氯乙酸-离心除去蛋白）•植物组织：新鲜样品5g+70~75%乙醇-沸水浴中回流提取20min-过滤-残渣重复提取3次-过滤，合并滤液-沸水浴中蒸去乙醇-用乙醚萃取-水层蒸干-+0.02mol/LHCl生理体液与液态食品中游离氨基酸的测定血浆：新鲜血浆1mL+1mLpH1.5柠檬酸缓冲液-冰箱中放置30min-高速离心（18000g/30min 或78000g/20min）¬脑脊液、眼内液：新鲜样液+等体积8%磺基水杨酸（1mL+6mL5%三氯乙酸，或2mL+10倍体积的80%乙醇），10000rpm离心¬尿液：5mL+4mol/LNaOH-pH11.5~12-置于盛有浓硫酸的干燥器中-减压抽真空约6h使氨气充分挥发，调pH至2.2, 定容，上机。
¬酱油、果汁及含植物材料的液体食品：+9倍1%磺基水杨酸-7000~10000rpm离心影响分离的因素-1¬缓冲液的pH（更换缓冲液的时间）Cys对BufferA、BufferB缓冲液的pH及更换时间最敏感，BufferA pH偏高或BufferB缓冲液更换过早，Cys出峰提前与Ala（丙氨酸）粘连或重叠，相反，如果BufferA pH偏低或BufferB更换过晚，Cys则与Val（缬氨酸）粘连或重叠。
对于日立仪器来说：Cys对1#、2#缓冲液pH 及3#缓冲液的更换时间最敏感影响分离的因素-2¬修饰剂-醇BufferA未加或少加醇，Asp、Thr、Ser分离不良，但Gly、Ala分离变好，BufferA加醇过多，则对Asp、Thr、Ser分离有利，而对Gly、Ala分离不利，泵1的压力也会明显升高。
日立仪器用乙醇作修饰剂，SYKAM仪器采用甲醇作修饰剂。
影响分离的因素-3¬柱温温度影响出峰时间和峰宽，其中Asp和Glu对其最为敏感，Asp在30℃出峰在Thr后，45 ℃时则在Thr前。
温度过低峰变宽，影响分离，所以氨基酸分析柱温一般均取50~60 ℃。
柱温低利于Thr、Ser分离，但不利Tyr、Phe 分离。
日立仪器的分析在同一温度下进行，SYKAM仪器采用梯度升温。
影响分离的因素-4¬柱效使用后如发现氨基酸分离，特别是前面的Asp-Glu变差、泵压变高、Ileu-Phe段杂峰变多，氨台阶变高可能是树脂被污染。
污染源：样品中的蛋白、多肽、脂肪或重金属如铬淋洗液配置过程中的一些问题（1）试剂¬所有的化学试剂必须用分析级；¬被储存在塑料容器中的化学试剂决不能靠近氨盐或氨液；¬绝不要在处理氨的地方准备试剂；¬只使用小心清洗过的玻璃器具,绝不要碰到玻璃器具内部(因为皮肤上有大量游离态氨基酸)；¬要过滤试剂，只能使用0.45 μm 孔径的薄膜过滤器或仔细清理过的玻璃过滤器。
淋洗液配置过程中的一些问题（2）去离子水¬18.2MΩ/cm 去离子水¬新鲜¬自来水直接蒸馏后达不到需要的质量淋洗液配置过程中的一些问题（3）Buffer¬氨基酸分析的洗提液需要两种不同的缓冲液体系。
钠盐缓冲液用于蛋白质水解氨基酸的分析，锂盐缓冲液用于生理体液中的游离态氨基酸分析。
¬柠檬酸钠或柠檬酸锂缓冲液有两个作用:钠或锂离子同氨基酸在树脂上磺酸基--SO3-结合交换位置。
剩余的柠檬酸根作为“缓冲”，可以获得不同精确的pH值，使得氨基酸逐一与磺酸基--SO3解离。
谷氨酰胺和天冬酰胺的分离只能用锂盐缓冲液来分离，而不能用钠盐缓冲液。
淋洗液配置过程中的一些问题（4）Buffer的配制¬溶液的pH值受温度影响，因此，标准缓冲液须在不同温度中校正。
¬应尽量避免调整pH值时从不足调到超出，因为无论是NaOH或LiOH都会改变缓冲液的当量浓度¬在调整pH后，应继续等待10 到15 分钟待pH 稳定后再检查一遍。
淋洗液配置过程中的一些问题（5）¬茚三酮溶解茚三酮晶体的溶剂通常使用乙二醇甲醚（MCS）或二甲基亚砜(DMSO)都可，大部分都使用乙二醇甲醚，但一定要保证它不含任何的过氧化物。
以上两种茚三酮试剂的吸光值结果(灵敏度) 是相等的，精氨酸的检测使用MCS茚三酮试剂更好，此外DMSO茚三酮试剂极易被氧化，难以长期稳定。
淋洗液配置过程中的一些问题（6）¬乙二醇单甲醚过氧化物测试：将5ml 5%的碘化钠溶液加入到5 ml乙二醇单甲醚中，如果溶液保持清澈则说明此乙二醇单甲醚溶液不含过氧化物，可以放心使用；如果溶液变成黄色，则必须再对乙二醇甲醚进行清理。
¬乙二醇单甲醚中过氧化物的去除:将30 g FeSO4x 7 H2O和3 ml H2SO4加入到60 ml去离子水中制成溶液；将此溶液10 ml加到1 L乙二醇甲醚溶液中并蒸馏，注意应剩余约10 %的溶液不蒸馏以避免发生爆炸。
淋洗液配置过程中的一些问题（7）¬醋酸钠/醋酸锂缓冲茚三酮反应的最佳pH值必须在pH5.0。
醋酸钠/醋酸锂缓冲液是一种强烈的缓冲液，无论洗提液的pH值是多少，混合后的溶液pH值总是5.0。