•实验6 叶绿体色素的提取、分离、 理化性质和叶绿素含量的测定
• 一、实验目的和要求：掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、 定量分析的原理和方法。
• 二、实验内容和原理：以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并 进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下：
1、叶绿素和类胡 萝卜素均不溶于
水而溶于有机溶 剂，常用95%的乙 醇或80%的丙酮提 取。
2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应
，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂
中的类胡萝卜素分开。
COOCH3
C32H30ON4Mg
COOC20H39
+ 2KOH
COO—
C32H30ON4Mg
COO—
+ 2KOH +CH3OH +C20H39OH
？ ？
• 3、取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环
C
褐色
绿色
• 4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光 下可见红色荧光。
透射光下呈绿色
反射光下呈红色
5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光 区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶 绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。
180
160
140 a
b
120
100
80
60
40
20
0
400
中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素
和绿色的铜代叶绿素。
• H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ 。
H3C
CC
R1— C C
N
HC
CH2
CH
C
C
C
C CH3
NC
HH
CH
—CH3
H3C—
C
H3C
CC
R1— C C
N
HC
H3C—
CH2
CH
C
C
C
C CH3
NC
Cu
CH
—CH3
• 五、实验数据记录和处理
• Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645 • Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663 • CT (mg/L) = Ca+ Cb 或OD6521000/34.5
• Chla含量(mg/g.FW)= （Ca(mg/L)/1000）
500
600
700
Waverlength(nm)
• 三、主要仪器设备： • 1、天平（万分之一）、可扫描分光光度计（）、离心机 • 2、研具、各种容（量）器、洒精灯等 • 四、操作方法与实验步骤：
• 1．定性分析：
• 鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆
•
过滤入三角瓶中
观察荧光现象 透射光 色，反射光 光 。
2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
皂化反应的上层 黄色石油醚溶液
反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜 素,离心得叶绿素(盐)
（稀释470nm OD 0.5-1）
（稀释6处扫描光谱，分别测定类胡萝 卜素和叶绿素的吸收峰
• 3．叶绿素定量分析： • 鲜加8叶0%0.丙1g酮，4加.81m.9l,m摇lH匀2O，，40磨00成转匀离浆心，3m各in取,上0清.2m液l 在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。
皂化反应(3ml)
加KOH数片剧烈摇均， 加石油醚5ml和H2O 1ml 分层后观察
上层呈 ，吸收 下层呈 。吸收
色，为 光。
色。为 光。
取代反应（1）
加 醋 酸 约 2ml ， 变 褐 （ 叶绿素）取1/2加醋酸铜 粉加热变 色， 为 叶绿素。
取代反应（2）： 鲜 叶 2-3cm2 ， 加 Ac-AcCu 20ml加热。观察： min 变为 色的 叶绿素， min后，变为 色的 叶 绿素。
•
2/ 0.1 5/ 0.2
• Chlb含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000）
•
2/ 0.1 5/ 0.2
• Chl总含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000）
•
2/ 0.1 5/ 0.2
•六、实验结果与分析
•1、吸收光谱图谱分析
•2、定量分析