2．涂片的要求 无论采用何种酶标记法，若 用涂片法则需要将涂片完全干燥以后方能检 测。若不干燥，在操作过程中易发生脱膜现 象。虽然在前处理时有固定这一步，但为了 使细胞表面的分化抗原少受因固定带来的损 失，往往选择的固定剂和固定时间均不十分 满意。若较薄的涂片标本干燥72小时，可省 略固定这一步，能提高部分细胞分化抗原的 阳性表达。但必须控制好试验的渗透压，以 免细胞破坏。
7．结果观察 结果观察要及时，酶标法虽然可 保存较长时间不褪色，但不如新鲜时颜色鲜艳， 易观察。如对结果有疑问，可重复操作，加以证 实。
8．阳性反应的了解 在检测前应明确被检细胞 的分化抗原所在的部位，即在细胞膜表面和细胞 浆中及细胞核内，以利标本的前处理和阳性结果 的准确判断，以免造成假阴性或阳性结果的误判、 漏判。
湿盒
吸水纸 移液器
镊子
DAKO笔
载玻片
试剂可选即用型试剂 盒(小于100名/年)或 购买原液自行配置 (大于100名/年)
选取厚薄适宜、髓(血)膜较长的骨髓或血涂片一张
用利器将骨髓膜划分成数个小块
划分前
3 10 19 DR
13 68 MPO
金会利 04102
划分后 用铅笔在磨砂玻面处写上与小块骨髓 膜所相应的标记号并写上姓名、检测编号。
目前可选用的标记酶有辣根过氧化物酶 （HRP）、 碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化 酶（GOD）、β－D半乳糖苷酶（β－D－Gal） 等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质 相对较稳定且价格适中，广泛地被临床和实 验室所应用
Ab-1（Mo）来自细胞Ab-2（Ho）Ab-3（Mo）
APAAP法染色原理
卵白素
（Avidin）
生物素化Biotion （HRP/AP）
ABC复合物
生物素化二抗
Ab-1
ABC法染色
细胞
原理图
多聚螯合物法(ELPS)
多聚螯合物法的特点
多聚螯合物法应用了一种突破性的技术即多聚物技术， 其在一条多聚肽链上螯合了相对应的第二抗和酶标志物。 此法是近几年来发展较快的一种新的免疫组化技术，更 由于酶连接方式较为直接，可进一步降低操作时一抗的 工作液浓度，可使反应更灵敏、整个背景染色更低、染 色时间短等特点。目前在临床上，特别是临床病理被广 泛应用。
5 非特异性结合的防止 抗体和组织 成分的非特异性结合（Fc受体），也 可引起非特异性染色。另外，由于电 荷性关系，抗体的阴电荷与组织中带 阳电荷的蛋白质发生非特异性粘附， 此时可加入与二抗同一种属源性的血 清加以封闭。
6．抗体孵育操作不当 可造成的背景 吸附及阳性细胞呈局限状产生，使结果 产生假阳性和假阴性。所以在整个操作 过程中均需在湿盒内进行，并注意加抗 体时勿使涂片干枯以免造成抗体分布不 均。
标本种类
可选择：① 新鲜血涂片或骨髓涂片。 ② 体液标本可离心后取沉淀物涂片。 ③ 实体肿瘤标本可采用 a 印片法、 b 穿刺涂片法、c 匀浆法等。
总之，一切有细胞的标本经过处理制成涂片 后均可检测。特别适合对细胞的定性。
选择较薄、长之涂片
1
将骨髓（血）分割成若干小块，间隙 用DAKO笔区分。并作相应记号。
该法也可分为一步法和二步法。一步法是将多聚物酶 分子直接结合在特异性一抗上，而二步法是将多聚物酶 分子连接在第二抗体上。
聚合物支架
Ab-2
Ab-1
酶基团（HRP/AP）
细胞 ELPS法染色原理(二步法)
免疫酶细胞化学技术
1．标本选择的特点 免疫酶标法可选择骨髓涂 片或抽取一定量骨髓液用淋巴细胞分离液提取 出单个核细胞。采用涂片机涂片，无论选用何 种方法，均要求标本新鲜。虽然本法是抗原-抗 体结合反应，但标本采集过久，会造成细胞表 面抗原的丢失。特别是淋巴细胞相关抗原。通 常标本采集一周后，其阳性率可明显下降。
3．标本的保管 标本采集后至结果观察完 毕以前，应尽可能避免接触与实验无关的化学 物品。特别是苯、二甲苯、醚、乙醇、双氧水、 醛等实验室常用试剂。因这些试剂具有强烈的 凝固或氧化蛋白质的作用。使细胞表面的分化 抗原减少，甚至失去，造成假阴性。
❖ 4．试剂的准备 各种试剂购进后，特别 是单克隆抗体，除参考产品说明书，尚 需结合各自的实验室条件，选定最佳稀 释速，即调整一抗、二抗、三抗等之间 的浓度，以求获得最佳特异性染色效果 和最低的非特异性背景干扰。同时每次 检测均需设置阳性细胞和阴性细胞的对 照，以检查方法的可靠性。
免疫酶细胞化学技术
免疫酶细胞化学技术是将抗原－抗体反应的 特异性与酶的高效，快速催化作用彼此结合， 由此形成一种既具有免疫荧光、放射免疫的优 点，又避免了他们的缺点。这项技术的原理和 操作与荧光法有许多相似之处，所不同的是用 酶来替代荧光素作为标志物，并采用底物被酶 分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。
9．结果的比较 结果观察的同时，必 须对同一标本的普通染色片（瑞氏染 色或H-E染色）和细胞化学染色结果进 行观察和比较，进一步确定具有临床 意义的病理性细胞和其免疫标记的阳 性情况，尽可能减少误诊和漏诊。
10．阳性标准的确定 结果判断由于受 检测方法、试剂盒的特异性及敏感性， 以及操作技术熟练程度等因素的影响， 其结果判断的标准化问题尚难统一。但 必须掌握阳性细胞定位明确，间质清晰， 无背景染色，病理性细胞阳性表达在5% 以上，才可视为阳性。
2
2357
10 19 20 22
13 14 33 34
68 M D 41
洗涤后，加二抗室温30分钟。
4
洗涤后，加显色液室温3-4 分钟。水洗，复染，待干。
5
固定后，各小块加相应一抗， 切勿混淆。室温30分钟。
3
甘油—明胶封片，镜检。
6
涂片法免疫标记检测流程图
整个操作仅需下列器材 及一台普通光学显微镜 即可。
3 10 19 DR 13 68 MPO 金会利 04102
用DAKO笔在小块骨髓膜之间划上一条蜡膜， 以阻止各小块上所加液体混淆。
13 O
04102
会 利
置入纯丙酮(AR) 固定5-10分钟。
13 M PO
04102
金 会 利
从固定液中取出立 即置入缓冲洗涤液 内浸洗，3×3分钟。
洗涤后取出，轻轻吸干 小块骨髓膜之间的水珠。 然后依次小心滴加单克 隆抗体，绝对不能混淆 和加错。