通过固相萃取和气相色谱串联质谱仪量化两个尿中代谢物有机磷阻燃剂Birgit Karin Schindler Katrin Förster Jürgen Angerer收到:2009年6月22/修改:2009年8月11 /接受:2009年8月12日/发表在线:2009年9月8日#施普林格-出版社2009摘要：磷酸三烷基酯广泛用作阻燃剂。

在动物的实验中主要代谢产物形成相应的烷基磷酸盐。

我们延长了原来的方法为确定我们的有机磷火焰阻燃代谢产物[二（2 - 氯乙基）磷酸酯，二苯基磷酸酯，DI-M-甲苯基磷酸酯和DI-P-甲酚磷酸盐]是能够确定DI-N-丁基磷酸盐（DBP）和二（2 - 氯丙基）磷酸（BCPP）人的尿液样本。

通过气相色谱 - 串联质谱法分析经过五氟苯甲基固相萃取，衍生溴化物和固相进一步清理后的提取物。

两个待测检测限为0.25μg/升。

估计值为2-6%。

为了表明该方法的适用性,我们选择了25个人的尿液进行实验。

12％的尿液样品分析测试呈阳性，浓度低于检测限为0.85μg/ L BCPP；一样本含有0.26μg/lDBP。

关键词：有机磷阻燃剂二烷基磷酸酯代谢物 DI-N-丁基磷酸盐二（2 - 氯乙基）磷酸酯 DI-2-氯乙基磷酸介绍一些研究证明有机磷阻燃剂在一些如土壤，水和空气等环境中具有普遍性（OPFRs）[1-9]。

对三-N-丁基磷酸三丁酯（TBP）和三两个OPFRs（2 - 氯丙基）磷酸酯（TCPP的）进行研究是因为它们的高产量和与毒理学的相关性。

TBP计算全球生产量高达5000吨，2001年[10]。

它是用来在飞机液压油中作为涂料添加剂和在地板中提供增塑和阻燃性能的。

更进一步，它是用来作为溶剂提取稀土元素。

TCPP作为一个以阻燃性刚性和韧性的聚氨脂泡沫材料它在1997年的全球产量超过40000吨在[11]。

近年来，TCPP已作为主要取代三（2 - 氯乙基）的磷酸盐.TBP被称为是一种致癌物质，在实验中从动物胎儿中毒毒物内已经提取出该物质[12-15]。

TCPP怀疑具有致癌性[16]。

在动物实验中，TBP和TCPP迅速被吸收，并以其为分布式分布在动物的整个身体中。

主要的代谢产物在动物的血液和尿液中的有机磷阻燃剂是自发或由α-酯酶和磷酸磷酸水解酶形成相应的烷基磷酸盐[10，17，19，20]。

由于TBP和TCPP的毒性和广泛的适用性，对于确定使用那些有机磷阻燃剂对于人类的伤害程度是很有必要的。

因此，一个灵敏的和有选择性的方法被研究出来用来确定DI-N-丁基磷酸盐（DBP）和二（2 - 氯丙基）磷酸酯（BCPP）（图1），主要TBP和tcpp人类尿液样本中的代谢产物。

我们最近公布了对人类的第一种监测生物有机磷阻燃剂的方法[21]。

本方法是对先前的一种的方法的补充，测试来源于占有德国总人口数25%的德国南部。

实验化学药品和试剂去离子水制备的一个耗材更换方案系统(Millipore,Eschborn，德国)。

乙腈（色谱纯溶剂，去水溶剂），丙酮，正己烷，甲苯，盐酸（37％）和碳酸钾购自默克（德国达姆施塔特）。

2、3、4、5、6-五氟苯甲基溴化物购自于奥尔德里奇化学(Steinheim、德国)。

5克的2、3、4、5、6-五氟苯甲基溴化物用6毫升的乙腈(色谱纯溶剂)稀释并通过试剂衍生法进行探究。

包膜蛋白来源于Biotage公司（瑞典乌普萨拉）（500毫克，毫升）。

Bond Elut PSA（500毫克，毫升）和Bond Elut FL（500毫克，毫升）来源于瓦里安（米德尔堡，荷兰）。

DBP（纯度97％）购自Fluka（Deisenhofen，德国）。

BCPP（纯度大于91％）和DBP-D18（纯度大于96％）和标记标准由Kadem（德国哥廷根）制定合成BCPP-D2（纯度更大的占98％）。

仪器仪表气相色谱 - 串联质谱（GC-的MS / MS）系统组成的气相色谱仪（CP-3800，瓦里安，达姆施塔特，德国）和自动进样器（CP-8400，瓦里安，德国达姆施塔特）耦合滨藜四极质谱仪（1200L，瓦里安，达姆施塔特，德国）。

瓦里安VF-35MS （35％苯基甲基聚硅氧烷）毛细管列（,0.2560米-毫米内径，0.25;瓦里安德国达姆施塔特）used.The瓦里安工作站6.41软件程序，用于分析。

DBP和BCPP用（1克/升）乙腈保存。

它的保存方法为(1 g / l)被稀释到一个标准工作与水混合溶液的浓度,（10毫克/L）。

也准备了五校准标准的浓度5至50µg / l进行尿液收集。

按照5毫升为一表样被分装起来。

阻燃代谢物内部标准图1 阻燃剂的结构，代谢物的分析和相应的内部标准氘标记的两个标准的联合解决方案（DBP-D18，-D2 BCPP;图1），为1g / L，准备在乙腈稀释混合的内部标准工作液用乙腈（10mg / L时）。

在18°C的无光条件下进行储存。

样品制备及固相萃取作为出版的样品制备。

简而言之,尿液样品酸化,20µl掺入内部标准溶液和丰富固相萃取方法使用ENV +墨盒。

为衍生,2,3,4,5,6五氟苯甲基添加到乙腈提取物中。

在第二个固相萃取过程中，进一步情理多余的衍生剂。

浓缩后，通过gc - MS / MS进行测量。

仪器分析分析装在分流到1μL毛细管的每个样品。

氦气作为保护气，流速是1.5ml/min。

喷油器的温度为260°C，转移管的温度为280°C。

加热源为200°C。

前0.5min柱温保持在80℃。

在1min的时间内以25°C /分钟的速度加热到110°C 。

然后到了以25°C/分钟的速度加热到270°C，然后再以20°C /分钟的速度加热到到290°C,维持 2分钟,最终温度提高到300°C,在那里维持8分钟。

这两个样本被清洗至少14分钟。

确定了待测峰定量和确认离子五氟苯甲基的每个代谢产物，如表1所示。

研究课题和样品采集要显示验证方法的适用性，25份的尿液样本，随机选择从德国南部人口进行分析。

受试者没有从事有机磷阻燃剂研究工作。

人口样本有如下特点：12名女性和13名男性，年龄介乎24和57岁，平均数为41岁。

只有一个是吸烟者，肌酸酐水平不等从0.26到1.45克/ L，中位数为的0.72克/ L。

样品储存在未经任何预处理的聚乙烯容器，等待分析。

日常运作和质量控制程序汇集多个捐助者的尿液样本，标上两种浓度的标准溶液，10-30μg/ L，作为质量控制材料。

这两个控制材料,一个空格水样本和全面的校准样本,提取和分析每一个样本。

通过绘制校准内部标准峰面积比标准与使用浓度瓦里安工作站6.41回归的软件程序比重的1 / X。

方法验证定量离子跟踪信号噪声的定义检测（LOD）。

在我们检测的时间内，由于方法不是十分精确，必须进行重复的实验监测。

重复性的研究，添加两个浓度10μg/ L 的（Qlow）及30μg/ L（Qhigh）的尿液样本分析。

相对的回收率分别由八个不同的分析确定0.233.27克/ L肌酐水平的尿液样本添加两种浓度的标准溶液，为20μg/ L（克洛）和40μg/ L（chigh）。

这个比率的峰值区域的分析物和内部标准与标定图相比,获得相对恢复。

离子被用来确认为目标分析物的检测峰值。

比例定量离子确认离子从标准确定的比例是一致的。

定量的比例不少于20％的变异离子确认离子被接受。

表1确切的给出了保留时间。

结果与讨论我们扩大了我们先前公布的方法[21]在人类尿液样本有机磷阻燃剂代谢产物的测定。

DBP和BCPP可以分析连同在一个运行的其他有机磷阻燃剂代谢产物。

图2显示了GC-MS/MS色谱本地尿液样本含0.26μg/ L DBP和0.85μg/ L BCPP 以及作为二（2- 氯乙基）磷酸酯和二苯基磷酸盐。

DI-M-甲酚磷酸和DI-P-甲酚磷酸只可在尖刺尿液样本中检测。

在验证过程中，该方法被证明是可靠的。

表2表明，氘标记的内部标准每种分析物是必不可少的实现验证数据。

检测限为0.25μg/升DBP和BCPP的。

该方法的灵敏度和选择性是显而易见的。

校准曲线在整个测量范围内呈线性关系，与皮尔逊的相关系数比为0.999。

八种不同的尿液样本，提取出两个不同的进行分析，在回收率和反映基质效应的情况下，以确定相对浓度。

平均值（范围）相对回收率分别为97.2％（94-101％）和97.5％（95-102％），20和40μg/lDBP，分别和100.6％（99-111％）and100.8％（94-108％）两个浓度BCPP。

具有良好的准确性的方法，考虑到这些数值得到的尿矩阵极为不同。

8个尿液样本浓度被认为是LOD值（DBP）和LOD值之比，为2.5μg/ L BCPP。

获得的数值比例分别为3.5％（DBP）和5.0％（BCPP）Q低2.9％（DBP）和3.5％（BCPP）Q高。

确定的八个日内的测试结果不同天数分别为5.2％（DBP）和5.5％（BCPP）Q低3.7％（DBP）和1.8％（BCPP）Q高。

那些值不精确点说明了目前的方法生产高度重复性的结果。

文物从标记的内部标准中，没有空白水样中的任何痕迹分析物，因此，可以排除空白有关的问题。

应用有效的方法研究从本地总人口的25个尿液样本。

DBP一个尿液样本中的浓度为0.26μg/ L。

12％的尿液中被确定BCPP之间的浓度低于分析样品LOD和0.85μg/ L。

我们能够证明这方法是不能敏感检测背景水平总人口以及职业较高浓度暴露的工人。

我们的研究结果表明总人口的一部分都有有机磷阻燃剂，特别是二（2 - 氯乙基）磷酸（50％），二苯基磷酸酯（30％）和BCPP（12％）在总人口中的尿液样本的比例较高。

代表性的研究是必要的用来以确认这些结果。

结论我们先前公布的方法，可以延长两个额外的有机磷阻燃剂代谢产物的测定。

经过固相萃取，衍生和第二固相萃取步骤，测量有机磷阻燃剂代谢产物浓度可确定其在运行。

这是高重复，可靠灵敏和选择活性的表征方法。

作为一个优秀的结果样品净化，最小的系统维护是必需的。

由于该方法灵敏度高，是有可能的确定有机磷阻燃剂代谢产物的浓度在人类的第一次尿液样本。

现在可以确定在德国的总人口中的平均水平。

通过实验证明了人类的代谢产物中含有有机磷阻燃剂的成分。

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