β—肌动蛋白的克隆与验证李亚楠邹曾阳孟冠奇李军张建忠沈彤摘要：Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。
Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。
Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-acti n(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。
[1]β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。
具有收缩功能，分布广泛。
β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot 很好的内参指数。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。
它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
[2]本次实验主要通过PCR的手法来扩增目标蛋白。
通过组织细胞提取DNA，用琼脂凝胶电泳来验证是否得到目标DNA；回收后的目标DNA 用PCR仪扩增，并用电泳进行回收；与T载体（PUD-18T）连接；用培养的大肠杆菌DH-5a来制备感受态细胞；将制备完成的感受态细胞均匀的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培养基平板中进行蓝白斑的筛选；最后提取质粒DNA，经验证后保藏菌种。
关键词：β-肌动蛋白横纹肌蛋白质PCR1材料与方法1.1 组织细胞DNA提取。
[3]1.1.1 试剂：细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TE缓冲液、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸铵。
器材：胶头滴管、离心机、烧杯、动物组织、研钵、水浴。
1.1.2 方法取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于石英研钵中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K20微升，混匀。
在65℃恒温水浴锅中水浴20min，间歇震荡离心管数次。
于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
加2倍体积的异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100微升吸头挑出晾干，用200微升TE重新溶解。
加等量的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）振荡混匀，离心12000rpm 5min。
取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l乙酸铵，加入2倍体积的无水乙醇，混合后室温沉淀2min,离心12000rpm 10min。
小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。
用1ml 70％乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm5min。
小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。
加200微升TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。
1.2 PCR扩增1.2.1 器材：PCR仪、移液枪、上下引物、去离子水、反应缓冲液，模板DNA、组织DNA1.2.2 方法在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性（高温使双链DNA解离形成单链。
）、退火（低温下，引物与模板DNA互补区结合）、延伸（中温延伸，DNA聚合酶催化引物为起始点的DNA链延伸反应与），体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA在PCR管中依次加入下列溶液：PCR预混液12.5微升、去离子水9.5微升、上游引物1微升、下游引物1微升、组织DNA1微升。
共计25微升体系设置PCR反应程序： 94℃ 5min94℃ 30s58℃ 30s 32个循环72℃ 1min72℃ 8min1.3电泳1.3.1仪器：水平电泳槽.电泳仪.凝胶成像分析系统.微波炉.微量移液器.透明胶带.点样板.100ml或250ml锥形瓶.量筒.吸头等。
试剂：50x TAE.Tris溶液.冰乙酸.EDTA溶液.去离子水.1xTAE缓冲液.琼脂糖.溴化乙啶贮存液.溴化乙啶.溴酚蓝.二甲苯青.甘油.其他：DNA样品.DNA Ladder。
1.3.2方法称取 1.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入150ml1xTAE瓶口倒扣小烧杯100℃加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀即成10％琼脂糖凝胶液。
胶板制备：取电泳槽内有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净，晾干.放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与槽两端边缘封好形成模子。
将内槽置于水平位置并在固定位置放好梳子，将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶完全凝固垂直轻拔梳子、取下胶带、将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1xTAE电泳缓冲液至没过胶板为止。
加样：在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1x。
用10微升微量移液枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品应该更换一个加样头以防污染，加样时勿碰坏样品周围的凝胶面。
电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100v。
样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动，电压升高琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1㎝处时停止电泳。
观察照相：在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
琼脂糖凝胶电泳回收按电泳回收试剂盒操作，回收电泳。
1.4 感受态细胞与T载体的连接1.4.1 设备：移液器、离心机、感受态细胞、T载体1.4.2 方法PUD-187 取0.5-1.0微升回收纯化的DNA 2微升或3-4微升，看具体浓度。
加水补至5微升，再加入5毫升SOLUTION1，冰上助融。
共10微升在16摄氏度放置30分钟，之后4摄氏度过夜。
1.5 细菌转化1.5.1 设备 LB液体培养基LB固体培养基，抗生素，，氨苄青霉素，配成100mg/ml，备用，0.1mol/L.CaCl2aq.接种针移液管，培养皿，净化工作台，摇床，恒温水浴锅，离心机。
X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-D半乳糖)X-gal溶于N，N＇-二甲基甲酰胺中配20mg/ml原液。
-20℃避光保存，IPTG（异丙基-β-D半乳糖苷）0.2g/ml分装贮存于-20℃，氨苄青霉素（Ampiaillin）1g Ampiaillin溶于5ml灭菌水中。
配成母液保存于-20℃1.5.2 方法LB液体培养基：胰蛋白酶1g，酵母粉2克，氯化钠1克，pH7.2-7.4（分装，20毫升/250毫升，三角瓶，3毫升试管0.07兆帕高压灭菌30分钟）。
LB固体培养基：LB液体培养基加入1.6%琼脂粉即可。
（分装50毫升/250毫升，三角瓶，加入8克琼脂粉0.07兆帕高压灭菌30分钟）。
1mol/l氯化钙（称取1.1克无水氯化钙，溶于90毫升蒸馏水，定容100毫升，装在250毫升三角瓶，0.07兆帕高压灭菌30分钟，4摄氏度保存）。
从-70摄氏度冰箱中取出感受态细胞，放入冰水中融化，放置大约10分钟。
用冷却后无菌吸头将连接好的DNA混合液加入到感受态细胞中（每100微升感受态细胞加连接产物5微升）旋转混合内容物，在冰上放置30分钟在将离心管放置于42摄氏度水浴锅热激90秒，切勿摇动试管。
迅速转移到冰浴中，令细胞冷却1-2分钟。
每管加400微升的LB液体培养基，转移到37摄氏度摇床温浴45分钟，转速不超过125转，使得细胞复苏（一般4-5小时菌液才能浑浊），摇完后4000转每分钟离心2-3分钟，弃去上清液200微升，使菌液浓度增加，用枪吹打后，再涂平板。
平板准备在40微升 X-gal（中加入4微升 IPTG充分混合，在无菌条件下涂布于含AMP（浓度50微升每毫升）的LB平板上将平板至于37℃恒温箱中2-3h，意识培养基充分吸收色素底物X-gal。
涂板将转化菌在无菌条件下涂布于含抗生素和X-gal IPTG的平板上正面朝上放置30分钟，待菌液完全被吸收后倒置平板。
37℃培养12-18h1.6验证1.6.1PCR扩增实验实验材料：仪器：吸头，PCR仪器，移液枪材料PCR预混液12.5微升，水9.5微升，上游引物1微升，下游引物1微升，组织DNA1微升实验内容及步骤：1配制25微升反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液中模板RNA 1微升上游1微升下游引物1微升，PCR预混液12.5微升，ddH2O0.95微升。
2.设置PCR反应程序[3]强变性 94摄氏度 5分钟变性 94摄氏度 30秒退火 58摄氏度 30秒延伸 72摄氏度 1分钟最后延伸 72摄氏度 8分钟共32 个循环1.上样启动反应程序2.扩增产物的电泳检测（取5毫升）1.6.2电泳实验所用设备：水电泳槽，电泳仪，凝胶成像分析系统，微波炉，微量移液器，透明胶带，点样板，锥形瓶，量筒，吸头。
50XTAE,Tris溶液，EDTA 溶液，去离子水，1XTAE缓冲液琼脂糖溴化乙叮贮存液，溴化乙啶，溴酚蓝，甘油，其他,DNA 样品。
实验内容及步骤：1.琼脂糖凝胶电泳的制备：称取1.5克琼脂糖置于锥形瓶中，加入150毫升 1XTAE 瓶口倒扣小烧杯100摄氏度加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成百分之1琼脂糖凝胶液。
2.胶板制备：取电泳槽内有机玻璃内槽洗干净晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与槽两端边缘封好形成模子。
将内槽置于水平位置，并固定位置放好梳子，将冷却到65摄氏度左右的琼脂糖凝胶完全凝固垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶剂内槽放入电泳槽中，添加1XTAE电泳缓冲液至没过胶板为止。
3.加样：在点样版上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1x，用1微升微量移液管枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品应更换一个加样头，以防止污染，加样时五碰坏样品周围的凝胶面。
4.电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100伏特，样品由负极向正极方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离，范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1CM处时，停止电泳。
5.观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带采用凝胶成像系统拍照保存。
1.6.3蓝白斑筛选[4]设备：培养皿，移液器，x-gal，IPTG，氨苄青霉素药品配置：X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖）:X-gal溶于N，N＇-二甲基甲酰胺中配20mg/ml原液。
-20℃避光保存，IPTG（异丙基-β-D半乳糖苷）0.2g/ml分装贮存于-20℃，氨苄青霉素（Ampiaillin）1g Ampiaillin溶于5ml灭菌水中。
配成母液保存于-20℃IPTG(异丙基-β-D半乳糖苷):0.2g/ml分装，贮存于-20摄氏度氨苄青霉素（Ampicillin）1g Ampicillin溶于5ml灭菌水中，配成母液，保存于-20摄氏度步骤：平板制备：在40微升x-gal中加入40微升IPTG，充分混合，在无菌条件下涂布于含有AMP的LB培养基平板上，将平板至于37摄氏度恒温箱中2-3小时，以使培养基充分吸收色素底物x-gal。