⑴ 分子量相对较小，在细菌中稳定存在， 拷贝指数高。
⑵ 具有遗传标记： 如抗生素性基因 —半乳糖酶基因（LacZ）
⑶ 具有多个酶的单一切点。称多克隆位点（ multiple cloning sites , MCS）
如 PBR322(人工合成)4.3Kb ：含 AmP( 氨卞青霉素)、 Tet(四环素)
2-3字母： 小写：细菌种名 如 EcoR 1
4 : 大写: 菌株
1，2…: 分离到的次序
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3.酶的识别和切割位点: 通常4-6bp,具有回文结构(palindrom)
（1）产生粘性末端(sticking end) 5＇-末端: EcoR 1: 5＇-GAATTC-3＇ 3＇-CTTAAG-5’
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C.若Lac Z基因被外源DNA插入而破坏，则不能制造半乳糖 苷酶，菌落为无色（白色）。
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②取代型载体（又叫替换型载体） 理P258
图8-4基因工程原
在DNA分子的中央，插入一段DNA片段： 具有多克隆位点的反向重复序列 当外源DNA插入时其可被置换掉 作用：提高了克隆外源DNA的能力。
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5、末端脱氧核苷酰转移酶 ：末端转移酶
作用：在DNA的3＇-OH上，加上 dNTP
6、Taq DNA聚合酶 和其它耐热DNA聚合酶
PCR时
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内切酶、碱性磷酸酶、连接酶的作用
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第二节 载体
*本质：DNA 携带外源DNA进入受体细胞的运载工具。
*分类： 克隆载体
质粒 入噬菌体 粘性质粒 M13噬菌体
2、 粘性质粒（Cosmid）：容量40-50kb
*由DNA的Cos区与质粒构建 *环状双链DNA 特点；①含质粒的抗性标记如Amp，Tet
②带Cos区，可进行体外包装 ③一个或多个酶切位点 ④分子量小，容量大 /筛选AP平板
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3、 M13噬菌体（M13 phage）
（1）大肠杆菌噬菌体 （2）基因组DNA全长6.5kb（单链） （3）感染后，可复制成双链DNA（RF，DNA） （4）当RF→100—200后，只有（+）链复制
⑴ 特点
① 双链DNA分子（线性或环形）
② 两端具有12个nt单链互补粘性末端
③具非必需区（中间区约1/3长度）
④可在E.Coli中大量繁殖
⑤可克隆15Kb左右的外源基因
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噬菌体的溶原周期和溶菌周期
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⑵ 载体类型 （两种）
插入型载体：外源DNA克隆到分子上，使噬菌体的某种生物 功能丧失效力，即插入失活效应。
24个单一切点
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PBR322
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质粒的构建
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质 粒 携 带 外 源 基 因
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2. 噬菌体：最大容量：9—23kb 感染细菌的病毒 根据生活周期分
溶菌性（Lytic）：在细菌中连续增殖直到细菌裂时， 释放噬菌体。
溶原性（Lysogenic）：将其DNA整入细菌中。 **只有双链DNA的噬菌体才具有溶原周 期。
表达载体
大肠杆菌表达载体 哺乳动物表达载体
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质粒载体
大肠杆菌质粒载体 PBR322 枯草杆菌质粒载体 PNC3 酵母菌质粒载体 农杆菌Ti质粒载体 Ti
噬菌体载体
噬菌体载体 Cos噬菌体载体
病毒载体
SV40病毒载体 乳头瘤病毒载体
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Hale Waihona Puke 一 常用的克隆载体1. 质粒（plasmid）：
种类很多，但作为克隆载体须具备。
如：—半乳糖酶失活的插入型载体（蓝白筛选） 编码
A :载体中含一个LacZ基因 半乳糖苷酶
X-gal(无色)
X(蓝色)+gal(半乳糖)
*其中X为有色基因：（4-溴-5-氯吲哚）与gal结合
成无色的X-gal
B:在含X-gal的培养基中，在Lac操纵子诱导物IPTG（异丙硫半 乳糖苷）作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，此菌落为 蓝色。
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二 修饰酶
对DNA 或RNA 末端进行剪切、补平、连接及化 学修饰的酶。
1、DNA聚合酶 活性.
大肠杆菌中第一个发现，MW 109KD
方向：5＇3＇ 还具有5‘3’及3‘5’外切酶
缺口平移法标记DNA时常用
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2、逆转录酶 （reverse transcriptase） 两类：禽类成骨细胞性白血病病毒逆转录酶（AMV） moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）
4种常用载体的比较 P146 表8—2 筛选：蓝白筛选
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二. 表达载体（expressing vector）
在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。
㈠ 大肠杆菌表达载体 除克隆载体的特性外还含有：
表达系统元件
启动子 核糖体结合位点 克隆位点 转录终止信号
启动子：常用的有
trp-lac启动子（or tac启动子） 噬菌体Pc启动子 T7噬菌体启动子
3＇-末端:Pst1 : 5＇-CTGCAG-3＇ 3＇-GACGTC-5＇
（2）产生平末端(blunt end):
Sma1:
5＇-CCCGGG-3＇
3＇-GGGCCC-5＇
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4.同功异源酶(isochizomers): 来源不同, 识别和切割位点相同
如:BamH 1 和 Bst 1
5.同尾酶(isoaudamers): 识别序列不同,但产生相同的粘性末端 BamH 1 :GGATCC Sau3A 1: NGATCN
第八章 基因工程
1
重组DNA技术
2
3
4
5
6
基因工程的应用
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第一节、工具酶
一、限制酶（restriction enzyme）：限制性内切酶 1、分类 根据酶结构、作用及DNA结合和裂解的特性
1 类：限制和修饰作用 * 2 类：识别DNA内部位点、切割双链
3 类：同类．
2、命名
首字母： 大写：细菌属名
方向：5‘3’
作用NA ligase） 将3＇-OH 与5＇-P 连接形成3＇, 5＇-磷酸二 酯键
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4、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）
去除DNA or RNA 5＇-P，制备载体时可防止载 体自身连接， 提高重组效率。
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㈡哺乳动物表达载体
除含有原核序列：在E-Coli中的复制起始点、便于筛选
的抗性基因
还包括真核表达元件
启动子/增强子
克隆位点
终止信号和加poly（A）信号
基因工程的受体系统
原核受体 E-Coli受体系统 外源基因复制、扩增场所 链霉菌受体系统 外源基因表达场所