蛋白酶抑制剂基因及转基因植物研究进展摘要：植物蛋白酶抑制剂是除Bt之外又一个愈来愈研究较多的抗虫基因资源，其分布广泛，在豆科、茄科、禾本科、葫芦科及十字花科等植物中存在较多。

植物蛋白酶抑制剂抗虫基因主要通过2种途径获得并在多种植物中进行转化，获得抗虫转基因植株。

植物蛋白酶抑制剂在基因工程中的应用已有很大的发现进展。

关键字：蛋白酶抑制剂基因作用机理转基因正文：一蛋白酶抑制剂作用机理广泛存在于植物组织中的蛋白酶抑制剂是一种多肽物质, 对许多昆虫有防卫作用。

该基因及其编码区域较小、没有内含子。

研究表明, 这些蛋白酶抑制剂在植物对危害昆虫以及病原体侵染的夭然防御系统中担当着重要角色。

昆虫饲喂实验发现, 某些纯化的蛋白酶抑制剂具有明显的抗虫作用。

利用蛋白酶抑制剂基因来提高植物的抗虫能力, 已成为植物基因工程研究的一个热门领域。

在植物中发现有三类蛋白酶抑制剂: 丝氨酸蛋白酶抑制剂, 琉基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。

其中对丝氨酸类蛋白酶抑制剂的研究最为透彻, 目前在植物中至少已经发现有6 个家族, 其中的弧豆胰蛋白酶抑制剂, 马铃薯蛋白酶抑制剂兀的抗虫效果最为理想。

蛋白酶抑制剂的杀虫机理蛋白酶抑制剂杀虫的机理在于: 它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用形成酶抑制剂复合物( E l ) 阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用。

所以, 一旦昆虫摄食进蛋白酶抑制剂, 就会影响外来蛋白的正常消化, 同时, 蛋白酶抑制剂和消化酶形成E l 复合物, 能刺激消化酶的过量分泌, 通过神经系统的反馈, 使昆虫产生厌食反应。

由于蛋白酶抑制剂抑制了昆虫的进食及消化过程, 不可避免地将导致昆虫缺乏代谢中必需的氨基酸, 最终造成昆虫的非正常发育或死亡。

二植物蛋白酶抑制剂基因作用机理及获得的途径蛋白酶抑制剂基因的作用机理及其应用蛋白酶抑制剂( P l ) 是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一, 存在于所有生命体中。

国内外有关抗虫的植物蛋白酶抑制剂基因的获得大多通过2种途径。

一种通过从植物不同部位的组织或细胞中提取抗虫活性蛋白，然后分析其起作用的活性核苷酸序列，继而克隆和转化到寄主细胞，进行筛选和选育抗虫树种。

利用该方法获得抗虫树种的研究越来越多，该方法中最为关键的环节是蛋白酶抑制剂提取和活性测定方法的选择和建立。

植物蛋白酶抑制剂分离和纯化的策略主要依据不同植物中的蛋白酶抑制剂生理生化的性质和特点，设计试验方案和步骤。

植物蛋白酶抑制剂属于分子量较小的蛋白质或多肽，在分离和纯化时主要利用其溶解度、分子量、电荷、等电点等性质，单独或联合使用几种如梯度洗脱、分子筛层析、亲和层析、电泳等经典技术，达到分离和纯化的目的。

但不同植物蛋白酶抑制剂的分子量、电荷等特性有差异，在分离不同植物蛋白酶抑制剂时所选用的层析介质、缓冲液的pH和浓度大小、电泳时的分离胶和浓缩胶的浓度和交联度都有差别，这些均需要通过深入了解不同植物来源蛋白酶抑制剂的特性设计相应的试验技术。

就目前已提取的蛋白酶抑制剂而言，大多数蛋白酶抑制剂都具有耐热性和相对分子量小的特点。

从水稻种子中提取的水稻巯基蛋白酶抑制剂，其分子质量为12．0 ku，在100℃下温浴30 min，其抑制活性没有改变；曾仲奎等分离水稻种子获得的巯基蛋白酶抑制剂也具有该特点，证实了Abe等试验结果的可靠性，而后又分别从玉米、百合、小麦等农作物中分离到了巯基蛋白酶抑制剂，获得了一致的试验结果。

从防己科植物波叶青牛胆分离到一种胰蛋白酶抑制剂(TCTI)，其相对分子量为10．0 kd，在100 oC下加热60 min，仍保持93％的抑制活性；王从海芋、从花生中均分离到胰蛋白酶抑制剂，并证实了丝氨酸蛋白酶抑制剂也具有上述特点。

基于蛋白酶抑制剂的特点，在其分离时大多数研究者采用对蛋白酶抑制剂提取液加热的方法以除去大量不耐高温的杂蛋白，从而极大地简化了试验步骤。

为获得较纯的蛋白酶抑制剂样品，目前通过HPLC、RP．HPLC和FPLC色谱研究方法越来越多，极大地提高了样品的纯度，为获得蛋白酶抑制剂的结晶和研究其空间结构及特性提供了技术保障。

有关蛋白酶抑制剂活性测定，传统的方法主要利用酶和抑制剂作用的动力学测定法，但该方法的缺点是花费时间长，试验条件不易控制，容易造成试验误差。

近年来随着电泳技术的日臻完善，新的快速、准确的鉴定方法应运而生，应用一种快速聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定了蛋白酶抑制剂，应用SDS—PAGE一明胶电泳检测了植物蛋白酶抑制剂。

该方法主要根据特异植物蛋白酶抑制剂抑制靶蛋白酶的作用从而阻止水解的原理，借助明胶一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，经蛋白酶水解后，用考马斯亮蓝染色；是一种简便、直观、灵敏的检测蛋白酶抑制剂活性的方法，该方法还可以进行大量样品的筛选工作，极大地加快了蛋白酶抑制剂的活性测定。

另一种获得植物蛋白酶抑制剂抗虫基因的途径是利用目前已有的植物蛋白酶抑制剂基因序列，比较其同源性，找出保守序列，在此基础上设计引物、扩增和测序，同时在构建目标材料CDNA文库的基础上，通过基因序列的比对，查找目标材料中是否存在该植物蛋白酶抑制剂基因的序列，在此基础上，通过相应的分子生物学技术扩增出目标材料中蛋白酶抑制剂的序列片段，找出基因全长的CDNA序列，然后在一定的载体上扩增和表达，得到目的蛋白序列，最后鉴定其功能。

三蛋白酶抑制剂转基因作物（GMO）发展进程自1987 年首次将豌豆蛋白酶抑制剂( Cow pea Tr ypsin Inhibitor, CpT I) 基因转入烟草并获得抗虫植株以来, 有关利用PI 基因获得抗虫GMO 作物的研究取得了很大的进展。

迄今为止, 自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂: 丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂。

其中只有前两者对昆虫的生长和发育有明显的抑制作用, 在抗虫GMO 作物中应用较广。

丝氨酸PI 与抗虫GMO 作物关系最为密切, 因为大部分昆虫肠道内的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。

目前已有多种丝氨酸PI 基因及其cDNA 被克隆, 包括豇豆胰PI 基因、马铃薯PI-Ⅰ和PI-Ⅱ基因、大豆胰PI 基因等, 获得了一批转PI 的烟草、水稻等作物, 其中, CpT I 的杀虫效果最好, 具有广谱抗虫性, 抗虫谱包括鳞翅目、鞘翅目和直翅目等害虫。

马铃薯PI-Ⅱ家族基因具有损伤诱导型启动子, 能更有效地抑制昆虫肠道蛋白酶的活性。

马铃薯PI-I 家族对类胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶具有专性识别能力, 主要抑制凝乳蛋白酶的活性, 但由于多数昆虫消化道内利用的是胰蛋白酶, 所以, 马铃薯PI-Ⅰ家族GMO 作物抗虫效果不理想。

巯基PI 在植物、动物和微生物中均有发现, 是一类可逆性竞争抑制剂, 其基因是用于防治那些利用巯基蛋白酶作为消化酶的害虫( 如大部分鞘翅目昆虫) 的优良基因。

Abe 等克隆出了玉米巯基蛋白酶抑制剂( Corn cystain, CC )的cDNA, 全长960 bp,含完整的编码序列, 成熟的CC 为135个氨基酸, 有Gly-Val-Ala-Gly 组成的保守区。

目前已获得转水稻巯基蛋白酶抑制剂的烟草和水稻, 试验证明对赤拟谷盗、米象、马铃薯甲虫、豇豆象等均有明显的抑制作用。

金属硫蛋白( MT ) 是一类低分子质量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白, 对金属离子Cd2+ , Zn2+ , Cu2+ 等有较强的亲和力。

2000 年报道了小鼠金属硫蛋白IcDNA 通过根癌农杆菌介导转入枸杞, 并由此产生了富集锌的GMO 枸杞。

目前酸性蛋白酶抑制剂只在赛莨苔属的一些植物中发现过, 其他植物中还未发现。

此外, 人们还发现了许多与抗虫性有关的新型PI 基因, 如韧皮部PI 基因, 瓜类受到害虫和病原菌侵害时, 韧皮部从伤口释放出含大量PI 的汁液, 可使伤口愈合。

现在已转入植物的PI 基因至少有10 多种, 主要来自大豆、豇豆、番茄和马铃薯等, 我国也已获得了转CpT I 烟草。

4 前景与展望在自然界中, 植物自身对害虫有多种防卫措施, 例如植物体内的各种次生代谢产物对害虫大都有毒性, 但这些物质的生物合成途径过于复杂, 很难用于抗虫转基因工程。

而且也不是所有的抗虫基因都适合转入植物。

目前抗虫基因工程中常用的是单基因编码的蛋白质, 如B. t . 毒素蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因等。

为了更好地推进植物抗虫基因工程的发展和应用, 今后应该在以下几个方面加强研究工作: 1) 随着昆虫及植物的进化, 需要不断寻找新型、高效的抗虫基因, 并深入研究其抗性机制。

2) 加强对抗虫基因在转基因植株后代中的遗传和表达稳定性的研究, 不断利用更新更强的启动子调节抗虫基因的表达。

3) 深入研究害虫产生抗性的机制并制定切实有效的抗性治理措施, 抗虫基因的引入与昆虫抗性管理应同时开展。

随着对抗虫GMO 作物研究的不断深入和基因工程产品管理和法律制度的逐渐完善, 抗虫基因工程商品化的前景是十分光明的。

植物抗虫基因工程作为生物技术花园里的一朵奇葩, 必将为21 世纪世界农业的大发展发挥更强的推动作用。

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