病理学技术（中级）
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概述
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十三 原位核酸分子杂交技术
【熟练掌握】 基本原理：标记核酸探针 核酸碱基配对原则 核酸的变性与复性 原位核酸分子杂交 原位检测杂交信号
十三 原位核酸分子杂交技术
【熟练掌握】 基本原理：标记核酸探针
核酸性质 放射性
DNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 放射性探针 非放射性探针
十三 原位核酸分子杂交技术
酶的作用下，从底物分离出的氢离子与无色的四唑盐或 双四唑盐相结合，形成红色或蓝色的双甲潜色素，该色 素沉着于酶作用部位，从而显示酶的存在部位。该法主 要用于显示各种脱氢酶。
十二 酶组织细胞化学技术
【掌握】主要方法的原理：3、色素形成法 在酶作用下，使底物的无色化学物质在作用的局部形成色
素沉着，从而达到显示酶定位的目的。 常用的有： ②靛蓝形成法：又称吲哚酚法，是以酯型吲哚酚化合物为
一些缺口，缺口处会形成3’-羟基末端，这时再在大肠杆 菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’-羟基上， 同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶 活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。其结果是使缺 口平移。根据这个原理，用高强度的放射性核苷酸（通 常为[α-32P]dATP）置换先前存在的核苷酸。用缺口平移 法标记的DNA探针比活性＞108cpm/μg，能满足大多数 杂交要求。
十二 酶组织细胞化学技术
【熟练掌握】 酶组织化学的影响因素：温度 酶反应的最适温度为37℃。温度较低时酶反应速度减慢；
而温度Байду номын сангаас高虽可使酶反应速度加快，但温度超过60℃时 ，大部分酶会因蛋白变性而丧失活性。
十二 酶组织细胞化学技术
【熟练掌握】 酶组织化学的影响因素：pH值 各种酶均有其适宜的pH值范围，在此范围内酶的活性最强
酚AS-D、萘酚AS-TR 等。 • 重氮盐种类不同，其偶氮颜色也有差异，可显示蓝、紫
、红、褐、黑、棕色等。 • 重氮盐有程度不同的酶活性抑制作用，故必须选用抑制
作用最弱者使用。
十二 酶组织细胞化学技术
【掌握】主要方法的原理：2、偶联偶氮法 偶氮色素法有两种： ①同时偶联法：酶在分解底物时生成无色的初级反应物，
，所催化的酶反应速度最大。大部分酶的适宜pH在7.0 左右，强酸和强碱均使酶失活。
十二 酶组织细胞化学技术
【熟练掌握】 酶组织化学的影响因素： 激活剂和抑制剂 能使酶活性增强的物质称为激活剂，而使酶活性降低的物
质称为抑制剂，多为一些金属离子或氧化还原剂等，如 镁离子：碱性磷酸酶的激活剂 钙离子：酯酶的激活剂 四异丙基焦磷酸胺：胆碱酯酶的特异抑制剂 丙二酸钠：琥珀酸脱氢酶的抑制剂 。。。
后者立即与重氮盐偶联，生成有颜色的偶氮色素。 ②后偶联法：为了防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶与
底物作用，产生分解产物沉着，然后再浸于重氮盐溶液 中形成偶氮色素。
十二 酶组织细胞化学技术
【掌握】主要方法的原理：3、色素形成法 在酶作用下，使底物的无色化学物质在作用的局部形成色
素沉着，从而达到显示酶定位的目的。 常用的有： ①四唑盐法：含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液在脱氢
，标记方法常采用酶促标记技术将α-32P或其他同位素标 记的核苷酸加入到核酸链中。 ① 缺口平移法 ② 随机引物合成法 ③ 末端标记法 ④ PCR合成法 ⑤ 体外转录法
十三 原位核酸分子杂交技术
【熟练掌握】 基本原理：标记核酸探针 ①缺口平移法 原理：首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造
十三 原位核酸分子杂交技术
【熟练掌握】 基本原理：标记核酸探针 ②随机引物合成法 原理：使长6～8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模
板退火，在DNA聚合酶Ⅰ或逆转录酶的作用下合成DNA ，在反应时将[α-32P]dNTP 掺入合成链，即得到标记。变 性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到 无数各种大小的探针DNA。因为所用寡核苷酸片段很短 ，在低温条件下可与模板DNA随机发生退火反应，因此 被称为随机引物。
十二 酶组织细胞化学技术
【掌握】主要方法的原理：2、偶联偶氮法 又称偶氮色素法，其基本原理是使用某种人工合成底物，
在酶作用下产生分解产物与重氮盐结合，引起偶联偶氮 反应，形成不溶性偶氮色素，以此对酶进行定位。
十二 酶组织细胞化学技术
【掌握】主要方法的原理：2、偶联偶氮法 • 常用的合成底物是萘酚系列化合物，如萘酚AS-BI、萘
十二 酶组织细胞化学技术
【掌握】 主要方法的原理：金属沉淀反应法、偶联偶氮法、 色素形成法 【熟练掌握】 酶组织化学的影响因素：温度、pH值、激活剂和抑 制剂
十二 酶组织细胞化学技术
【掌握】主要方法的原理：1、金属沉淀反应法 酶的分解产物可与大多数金属结合，金、银、铜、铁、铅
、钴及其化合物均具有颜色，因此，在酶反应时使其与 金属结合，利用其呈色反应，显示出酶反应的部位，间 接地证明某种酶的存在。该法主要用于显示磷酸酶，如 显示碱性磷酸酶的钙钴法和显示酸性磷酸酶的硝酸铅法 。
【熟练掌握】 基本原理：标记核酸探针 1、放射性探针的标记：即在核酸链中加入放射性同位素
的方法。 常用的放射性同位素有32P、35S、3H。其中32P由于能量高
，信号强，最为常用。3H能量低，半衰期长，只能用于 组织原位杂交。
十三 原位核酸分子杂交技术
【熟练掌握】 基本原理：标记核酸探针 放射性探针的标记，杂交信号通过放射自显影技术来检测
底物，酶作用于这些底物分解出吲哚酚，在氧存在的情 况下生成蓝色靛蓝，使酶所在部位显色。
十二 酶组织细胞化学技术
【熟练掌握】 酶组织化学的影响因素 酶组织化学反应中酶的活性是至关重要的。因此，在制备
标本及组化实验中必须做到既要最大限度地保存酶的活 性，又要保存好组织细胞的形态结构，以保证酶在组织 细胞中的准确定位。