ELISA
基本原理 方法种类 实验操作 应用 常见问题分析 写作实例
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ELISA
基本原理
➢ 全称：酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay） ➢ 原理： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附ห้องสมุดไป่ตู้”； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” ；
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过程（简单了解）：
抗原制备： 商品化或自行表达
多克隆抗体制备
基础免疫：首次， 抗原用量大，用弗 式完全佐剂（含矿 物油,卡介苗等)。
加强免疫：第2次以后， 抗原量减半，多次，间 隔2-4周，用弗式不完全 佐剂(不含卡介苗).
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抗原的基本知识
定义：抗原（antigen）是能够刺激机体产生免疫应答的效应物质（抗体和 致敏淋巴细胞），并能与之特异性结合的物质。
两个基本特性： 免疫原性（immunogenicity）：能够刺激机体产生抗体和效应T淋巴细胞的 免疫反应能力。 抗原性（antigenicity）：与免疫反应最终产物（如抗体和/或T细胞表面受 体）特异结合的能力。
完全抗原与半抗原
抗原表位（Epitopes）：抗原决定簇。 存在于抗原分子中，决定抗原特异性的基本结构 或化学基团。是与TCR/BCR及抗体结合的基本单位。
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抗体的基本知识
定义：antibody。指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细 胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
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➢ 抗原和抗体 ➢ ELISA ➢ Western blot ➢ 免疫组化（免疫荧光） ➢ Real Time PCR
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抗原的基本知识 抗体的基本知识 多克隆抗体 单克隆抗体
多克隆抗体制备
动物选择：
• 兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白） • 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠） • 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠） • 羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。 • 马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。 • 豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。
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ELISA
方法种类 其他方法
双抗原夹心法、竞争法、捕获法、基于细胞法
放血制备血清：
可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉)
佐剂的作用机理： 延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈
取血测效价： 加强免疫两次 或三次以后的第7 天取血。
促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化”
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多克隆抗体
抗原多个表位诱导多种B细胞克隆增殖与分化，产生多种抗体的混合物。
特点：
• 多抗是单抗的混合物，群体 综合的性质。
• 更容易捕捉抗原。 • 特异性相对较差：交叉反应 • 抗体的纯化、标记难。
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单克隆抗体
单个抗原表位诱导单种B细胞克隆增生与分化，产生单克隆抗体。
什么情况下需要制备单克隆抗体？
目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂
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结构与功能： 1）重链轻链； 2）超变区是抗原结合位，与抗原表位互补； 3）抗体Fc片段上两结构域共同与细胞膜
Fc受体结合，发挥不同的生物学效应。
应用
医学应用：
1.诊断：各类血清学检测，抗人球蛋白测试，早孕检测等。 2.治疗：单克隆抗体疗法（类风湿性关节炎多发性硬化症等），肿瘤治疗。
科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等。
辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP） （3）酶反应的底物。
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ELISA
方法种类
直接法——检测Ag
将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可 测定抗原总量。 优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。 缺点：实验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做 标记，费用相对提高。
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ELISA
方法种类
双抗体夹心法——检测Ag
将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶 标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物 的形成量与待测抗原成正比。适用于某些大分子的具有至少双 表位的抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。 优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。 缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。
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ELISA
方法种类
间接法——检测Ab
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标二抗，加底物显色。 优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分 析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。 缺点：交互反应发生的机率较高。