液相色谱—视差折光检测器

检测器组成：光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்

凝胶渗透色谱仪（GPC仪）、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理：利用多孔物质做固定相， 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器


荧光检测器：样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态，在返回到基态的过程中，会 发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector



A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.

凝胶渗透色谱（GPC：Gel Permeation Chromatography）——是液相色谱的一 个分支，以一定尺寸的多孔固体（凝胶） 作固定相，以液体作流动相，按样品分 子尺寸大小进行分离的方法。（类似于 气相色谱的分子筛填充柱）主要用于测 定样品中物质的分子量及分子量分布。 （环境水样也如此，目前很多研究与此 相关——消毒副产物、催化氧化、膜处 理）。
液相色谱—检测器



通用型检测器：视差折光检测器 。 选择性检测器：紫外吸收检测器、 荧光检测器、电化学检测器等。 紫外吸收检测器：样品有紫外吸收、 样品分子种有生色基团、有机物有 羰基、芳香基、烯基等 。
液相色谱—紫外可见检测器

单波长紫外吸收检测器：单色光 光源（低压汞灯254nm）——样 品——检测器（光电二极管）。
提高柱效—改变色谱峰的宽窄
液相色谱分析基本概念



液相色谱(LC or HPLC)——以液相 为流动相的色谱，或流动相为液体 的色谱。 液液色谱——以一种液体作流动相， 另一种液体作固定相的色谱。 液固色谱——以液体作流动相，以 固体作固定相的色谱。（俄国植物 学家）
液相色谱分析基本概念

柱色谱——把固定相装在一根管 子里（色谱柱），液体流动相流 过色谱柱中的固定相。
Injection port
液相色谱—进样阀


自动进样器：模拟手动进样过程。 注意：1、进样阀内部通道很细，不 能带有固体颗粒，所以水样需要用 滤膜过滤(0.45um or 0.2um)；2、 样品浓度不能太高，以免在进样阀 内析出结晶；3、经常清洗进样阀通 道。
Auto sampler
液相色谱—自动进样样品架
If wavelength scanning is desired, the flow is stopped long enough for the scan to take place.
液相色谱—紫外可见检测器

二极管阵列检测器：复合光（氘灯 或卤钨灯190-800nm）——样品— —单色器——阵列的检测器（光电 二极管）。
液相色谱—色谱柱

不锈钢材质、有柱管、接头和过滤 片，柱管内填充几微米的小颗粒填 料即固定相（当前仍以硅胶基质的 填料占主导地位）。通常4-8mm、 也有1-2mm的细管径分析柱，还有 1mm以下的毛细管分析柱。
液相色谱—色谱柱
液相色谱—色谱柱

色谱柱填料的不断进步是液相色谱 能不断解决成千上万分析难题的关 键。
State Key Lab of Biochemical Engineering
液相色谱—荧光检测器


柱前衍生：单一组分或衍生物易于 被色谱柱分离，则在柱前衍生后进 样检测。 柱后衍生：18种氨基酸经色谱柱分 离后，在柱后与茚三酮反应后在可 见波长条件下测定。
液相色谱—荧光检测器



色谱柱——低压泵三通注入衍生化试 剂——衍生化反应器（加热、光照 等）——检测器 光路： 复合光光源（氘灯190-600nm）——单 色器（光栅）——样品——检测器（900 角用光电倍增器检测发射光）。
UV/Vis
--Fixed Wavelength Detector
液相色谱—紫外可见检测器

可变波长紫外吸收检测器：复合 光光源（氘灯190-600nm）—— 单色器（光栅）——样品——检 测器（光电二极管）。
UV/Vis --variable wavelength detector

液相色谱分析基本概念

我们常用的液相色谱是指液固柱色 谱。
液相色谱仪的基本组成
Reservoirs
Solvent1 Solvent2
Vacuum pump
Auto sampler
Degasser1
Degasser2
Injection port
Precolumn
Mixing vessel
Filter Analytical column
Pump
Purge valve
四元梯度泵
--低压混合
A B C D
比 例 伐
to mixing chamber to waste
二元梯度泵
--高压混合
A
B
Pump
P
P
t
t
液相色谱—进样阀


进样阀是保证色谱分析准确度的重 要部件。 六通手动进样阀：罗达因 （Rheodyne）进样阀：两个位置， 一是取样，二是进样。有固定体积 的进样定量环管，0.5-100ul之间， 可根据样品情况更换选用。
Pressure gauge Pulse damper
High pressure pump
Detector
to MS
To waste
Signal collection
液相色谱—流动相



单一溶剂：甲醇、乙腈、四氢呋喃、 MTBE等或水。 混合溶剂：2种以上混合溶剂，如甲 醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸缓冲溶 液、己烷-乙酸乙酯等。 等强度洗脱：流动相组成和流量保 持恒定。
液相色谱—流动相


梯度洗脱：流动相组成比列和流量 随时间变化。需要比例阀、阀驱动 器、溶剂比例控制器、梯度程序器。 注意：1、溶剂需要带盖密封；2、 溶剂需要脱气处理：搅拌下真空抽 气或通入惰性气体（氦、氮）驱走 其中的溶解气体。
液相色谱—高压泵

有往复泵、注射泵、气体放大泵等， 不锈钢材质，主要是要能克服大阻 力以恒定流速输送流动相。
液相色谱—荧光检测器


a——吸收系数 b——吸收介质光程 c——样品浓度 应用：多环芳烃、黄曲霉毒素、核 黄素、卟啉类化合物等都能产生荧 光。
液相色谱—荧光检测器

不能产生荧光的物质——衍生化反 应使其产生荧光。如氨基酸、蛋白 质、糖类等重要生化物质并不能产 生荧光，衍生反应后接上一个发荧 光基团用荧光检测器来检测，灵敏 度很高。
常用填料： 硅胶、甘油基丙基键合、交联葡 聚糖或琼脂糖、甲基丙烯酸酯等。 主要公司：Merk, Pharmacia, Tosoh, Waters, Synchrom… (SEC, GFC, GPC)
液相色谱—凝胶色谱


各种命名：60年代发展起来的一种 快速分离和分子的液相色谱。 凝胶过滤色谱/分子筛过滤色谱/分子 筛色谱/排除色谱/分子排除色谱/凝 胶排除色谱/有限扩散色谱/凝胶扩散 色谱/体积色谱/凝胶渗透色谱/液体 排除色谱。
The UV/Vis source usually comes from a monochromator so the wavelength can be selected, or scanned.
Absorbance increases as eluate passes through the cell.
最低波长 极限/nm
290（280）
295 300 300 300 300 305 330 330
210（215） 二氯甲烷 210 210 1,1-二氯乙烷 氯仿
235（232） 苯乙醚 235 245 250 吡啶 丙酮 甲乙酮
210（195） 丁酸甲酯
液相色谱—紫外检测器
正辛烷 异辛烷 甲基环己 烷 正丁醚 210 210 210 210 210 （200） 210 210 （205） 210 （180） 215 （205 215 （205） 乙酸正丁酯 甲酸甲酯 乙酸甲酯 乙酸乙酯 254 260 260 260 溴仿 溴乙烷 异溴丙烷 正溴丁烷 335 350 350 350
Fluorescence Detector
• Short pass - transmits all wavelengths below a specified cutoff • Long pass - transmits all wavelengths above a specified cutoff • Band pass - blocks all wavelengths outside a specified band