常规冻存方法
下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍常规冻存细胞的详细过程。

✧主要材料
（1）仪器设备：普通冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机等；
（2）冻存管：容量为1ml或1.5ml；
（3）冷冻保护液：一般是以5份小牛血清、4份细胞培养基与1份DMSO 混合而成。

现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。

使用前，于室温下水浴溶解；
（4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。

✧操作过程
1.待冻存细胞悬液的制备
(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计
算细胞总数；
(2)将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；
(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～
1×107个/ml；
(4)按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；
(5)在冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。

2.分级冷冻
(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约30min；
(2)接着将冻存管臵于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；
(3)将冻存管转入低温冰箱（-800C），放臵过夜；
(4)最后将冻存管投入液氮保存。

3.记录
做好冻存记录。

记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位臵以及操作人员。

✧冻存结果
如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。

✧讨论
在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。

高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。

在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。

在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。

若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。

操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。

应注意控制冻存细胞的质量。

既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。

另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。

冻存细胞的复苏
✧主要材料
（1）仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；
（2）培养用液：完全培养液。

✧复苏过程
（1）调配370C～400C的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至370C～400C；
（2）从液氮中取出冻存管，立即投入370C～400C温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；
（3）将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液(或10ml)，轻轻吹打混匀；
（4）将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；
（5）向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。

（6）复苏第二天上午更换新鲜培养基，以弃去残余DMSO。

✧结果
复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

✧讨论
细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。

实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。