实验步骤说明**：1. 诱饵质粒pGBKT7-bait的构建2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测【重要的前期准备】3. 人胰腺cDNA文库的滴定和扩增【不用做了，直接用质粒】4. 转化AH109酵母后转化子（阳性克隆）的筛选【顺序转化或共转化】5. 蛋白质相互作用的验证【一对一验证】**2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测2.1 LacZ自激活的检测.2.2 HIS3自激活的检测2.3 融合蛋白对酵母菌的毒性检测4. 文库转化AH109酵母后转化子的筛选4.1 文库质粒转化pGBKT7-bait/AH109酵母使用标准的PEG/LiAc转化法将文库质粒转化入已含有pGBKT7-bait质粒的AH109酵母，涂布在SD-Ade-His-Leu-Trp平板上进行重组子筛选4.2 报告基因ADE2、HIS3和lacZ激活的验证ADE2、HIS3的激活：酵母能够在SD-Ade-His-Leu-Trp平板生长LacZ的激活：β-半乳糖苷酶显色反应呈蓝色4.3 pACT2-cDNA质粒的获取：①从酵母中抽提质粒，得到pGBKT7-bait和pACT2-cDNA的混合物②转化E. coli，涂布在含Amp的LB平板上，由于质粒不相容性，转化子中便只含有pACT2-cDNA质粒③从转化成功的E. coli中抽提出pACT2-cDNA质粒5. 蛋白质相互作用的验证【一对一验证】5.1 由于酵母双杂交的假阳性很普遍，所以筛选得到相互作用蛋白的cDNA序列之后，还应将分离出的各种pACT2-cDNA再次单独转化pGBKT7-bait/AH109酵母，即一对一验证，再次检测它们对报告基因的激活情况，排除假阳性5.2 将pACT2-cDNA质粒送测序，得到cDNA片段的序列，在NCBI数据库Blast查出其对应的蛋白质5.3 另外，还必须分析这些pACT2-cDNA质粒的构建情况。
由于商品文库构建的特殊性，要特别关注这些插入的cDNA片段是否发生了frameshift5.4 在上述验证都通过的情况下，仍然需要用诸如免疫共沉淀、GST-pull down、细胞共定位等实验来对这些相互作用来进行验证公司的这三个操作手册：相关质粒载体【更多详细信息见质粒图谱】酵母双杂交系统3的质粒信息Fusion 表位酵母筛选标记细菌筛选标记pGBKT7 DNA/bait c-Myc TRP1 kanamycin Control vectorspCL1 GAL4 LEU2 ampicillin图2.3 pGBKT7的限制性酶切图谱pGBKT7的多克隆位点图谱pCL1质粒图谱另外附上：文库质粒的载体pACT2 和AD-prey构建的载体pGADT7的信息：实验所用菌株基因型及其用途菌株 基因型用途E coli DH5αF-ф80dlacZ △M15 recAl endAl gurA96 thi-1hsdR17(rk-mk+) supE44 relA1 deoR△（lacZYA-argF ）U169用于质粒的扩增与转化AH109MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4, gal80LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3 : : MEL1UAS-MEL1 TATA-lacZ用于酵母双杂交中的诱饵融合蛋白的宿主菌及酵母双杂交筛选AH109酵母菌的报告基因：AH109酵母菌的表型：培养液和固体培养基●大肠杆菌培养基及相关试剂 LB 培养基：蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠10g加蒸馏水至1000mL ，调整pH 到7.0，高温高压灭菌。
固体LB 培养基：在液体LB 培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5-2.0％。
配制抗生素培养基时，氨苄青霉素的最终浓度为60μg/mL ，卡那霉素的最终浓度为50μg/mL 。
●酵母培养基及相关试剂【注意：含有葡萄糖，灭菌时间不要超过20min ，一般15min ，过长时间导致碳化变黑】无氨基酸酵母氮源（YNB）为Difco产品；L-Arginine HCl、L-Histidine HCl monohydrate、L-Lysine HCl、L-Uracill购自Sigma；腺嘌呤半硫酸盐（Adenine hemisulfate salt）购自Amresco；其它各种氨基酸均为国产分析纯。
YPD培养液：蛋白胨 20g酵母提取物 10g葡萄糖 20g加水至1000mL，调pH5.8，高温高压灭菌。
YPDA培养液：在1L YPD培养基中加入15ml 0.2％腺嘌呤半硫酸盐至终浓度为0.003％，调pH5.8，灭菌0.2%腺嘌呤半硫酸盐配方：0.4387g Ademin Sulfate 溶于200ml ddH2O 过滤灭菌，4℃保存固体YPDA培养基：YPDA培养液中加入琼脂粉至浓度为2.0％。
10×省却成分培养基（简称10×DO培养基）：按照下表的配方分别配制：一缺10×DO：10×DO/-Trp，10×DO/-Leu二缺10×DO：10×DO/-Trp/-His，10×DO/-Leu/-Trp三缺10×DO：10×DO/-Trp/-Leu/-His四缺10×DO：10×DO/-Trp/-Leu/-His/-Ade各种氨基酸在10×DO溶液中的浓度（按需要省去部分氨基酸）氨基酸10×浓度L-Adenine hemisulfate salt 200 mg/LL-Arginine HCl 200 mg/LL-Histidine HCl monohydrate 200 mg/LL-Isoleucine 300 mg/LL-Leucine 1000 mg/LL-Lysine HCl 300 mg/LL-Methionine 200 mg/LL-Phenylalanine 500 mg/LL-Threonine 2000 mg/LL-Tryptophan 200 mg/LL-Tyrosine 300 mg/LL-Uracil 200 mg/LL-Valine 1500 mg/L完全极限培养基(亦称缺陷型培养基、选择性压力培养基)：YNB 6.7g10×DO 100MLGlucose 20g加水至1000mL，调pH5.8，灭菌。
固体培养基：上述液体培养基加入琼脂粉至浓度2%。
酵母转化试剂【化学法转化】10×TE缓冲液： 0.1M Tris-HCl，10mM EDTA (pH 7.5)，高压灭菌。
50%(w/v)PEG3350：PEG3350 50g,用灭菌的去离子水溶解，至体积达100mL。
10×LiAc ：1.0M LiAc，用稀释的醋酸调至pH7.5，高压灭菌。
PEG/LiAc溶液（现用现配）：4/5体积的50%PEG3350, 1/10体积的10×TE缓冲液和1/10体积的10×LiAc 混匀，备用。
1×TE/1×LiAc溶液（现用现配）：1/10体积的10×TE缓冲液，1/10体积的10×LiAc，4/5体积的灭菌的去离子水，混匀，备用。
担体DNA 10mg/ml：0.5g 鲱鱼精DNA溶于50ml TE中，磁力搅拌3h，分装于1.5mlEP管，-20℃保存。
用时超声或沸水浴10minβ-半乳糖苷酶滤纸显色分析试剂X-gal储备液：X-gal溶于二甲基甲酰胺中，浓度20mg/mL，-20℃避光保存。
Z Buffer：Na2HPO4·7H2O 16.1g/LNaH2PO4·H2O 5.50g/LKCl 0.75g/LMgSO4·7H2O 0.246g/L调pH值至7.0，高压灭菌。
Z Buffer/X-β-gal混合液(现用现配)：Z缓冲液100mLβ-巯基乙醇0.27mLX-gal储备液 1.67mL感受态酵母菌的制备①将酵母菌AH109菌株划线接种于YPDA平板上，30℃培养3-5d后，平板上长出白色或粉红色克隆；②以灭菌的牙签挑取1个直径在2-3mm的克隆接种于装有1mL YPDA液体培养基的Eppendorf管中(若克隆直径小于2mm，应挑取数个克隆)，剧烈震荡5min以打散菌团；③将之转入含50mL YPDA培养基的三角瓶中，于30℃ 250rpm摇动培养16-18h，至酵>1.5)；母菌繁殖的稳定期(OD600值，④取30mL上述过夜培养物转入含300mL YPDA的三角瓶中，检查稀释培养物的OD600=0.2-0.3；若必要，加入更多的过夜培养物直至OD600应为0.4-0.6；⑤于30℃ 230rpm继续摇培养3h，此时OD600⑥收集培养菌液于50mL离心管中，1000×g，室温离心5min，弃上清；⑦以25-50mL灭菌TE或蒸馏水重悬细菌沉淀，1000×g，室温离心5min，弃上清；⑧用1.5mL新鲜制备的、灭菌的1×TE/1×LiAc重悬沉淀，即为感受态酵母菌。
质粒转化酵母转化实验分组组别质粒培养基预期表型阳性对照pCLl SD/-Leu 蓝色阴性对照pGBKT7 SD/-Trp 白色实验组pGBKT7-bait SD/-Trp 白色① 0.1μg诱饵质粒pGBKT7-bait、阴性对照质粒pGBKT7和阳性对照质粒pCLl分别与0.1mg鲱鱼精DNA于一新的1.5mL离心管中，混匀；②加入100μL酵母感受态细胞，震摇充分混匀；③加入600μL无菌的PEG/LiAc溶液，高速震摇以混匀；④30℃ 200rpm摇动30min；⑤加入70μL DMSO，轻轻颠倒混匀，切勿震摇；⑥42℃水浴中热激(热休克)15min，冰浴1-2min；⑦室温14000rpm离心5sec，移去上清，以500μL无菌的1×TE缓冲液重悬细胞；⑧取100μL涂布于相应的营养缺陷平板上，平放几分钟，至液体渗入琼脂中为止；⑨于30℃倒置培养，进行营养缺陷型筛选，直至克隆出现，一般需要2-4天。
β-半乳糖苷酶滤膜分析①用新鲜(如30℃生长2-4d)的，直径在1-3mm的酵母克隆进行β-半乳糖苷酶分析；②加入2-2.5mL新鲜配制的Z Buffer/X-gal溶液到干净的100mm的培养皿中；③将一张直径大小合适的滤纸放入上述盛有Z Buffer/X-gal混合液的培养皿中浸湿；④用镊子将一灭菌的干滤纸覆盖于培养基的表面，与克隆紧密接触。