操作步骤
载体及目的基因的酶切 酶切产物的纯化
载体与目的基因的连接
感受态细胞制备与转化
载体及目的基因的酶切
载体的酶切： 目的基因的酶切：
质粒(Bluescript) 10×Buffer
BamHⅠ EcoRⅠ ddH2O 总体积
4 µl 2 µl
1 µl 1 µl 12 µl 20 µl
实验四
基因的克隆与重组质粒的转化
实验目的
掌握外源基因与载体连接的原理及方式 理解重组体转化大肠杆菌的条件
了解转化的过程
实验步骤及原理
纯化载体 特定基因与载体连接
重组载体转化大肠杆菌
筛选含重组子的大肠杆菌
载体
外源DAN片段不能在细菌中稳定遗传，随细菌的繁
殖而扩增。须有载体携带进入宿主细胞 专为分子克隆提供的载体特点： 多为环形 含多克隆位点，可选择适当内切酶切开 含抗药基因，可使宿主在含某种抗菌素的培养基 上存活 可在宿主细胞中自我复制，也可随宿主细胞的繁 殖而扩增
实验组
感受态菌液 连接反应液 pBluescript 100μl 5μl
阳性对照组
100μl 1μ l
阴性对照组
100μl
42oC准确水浴90秒，迅速取出，置冰水浴。 各管加入amp+
LB培养液200 μl，混匀，37振荡复
苏45min。
转化（二）
取4皿amp+固体培养基，每皿加入IPTG8μl，
16oC保温4小时或过夜，-20oC冷冻保存
感受态细胞制备（一）
受体菌的活化
取冻存XL1-blue菌株，划线接种于LB(amp-) 固体培养基上，37oC培养过夜。 培养单菌落 用接种棒挑选单菌落接种于50ml LB(amp-) 液体培养基，37oC振荡培养6-8小时
制备感受态菌的最佳时机一般以菌液出现轻度混
PCR纯化产物+ ddH2O至 64 µl 10×Buffer
BamHⅠ EcoRⅠ
8 µl
4 µl 4 µl
80 µl
分别混匀，置37oC保温1.5小时
酶切产物的纯化
混合两组酶切产物，酚/氯仿抽提，乙醇沉
淀，方法见实验三。
载体与目的基因的连接
纯化产物溶于8 µl水中，再加入：
10×T4 DNA连接酶缓冲液 T4 DNA连接酶 总体积 1 µl 1 µl 10 µl
制备感受态细菌
CaCl2
0º C
重组DNA分子进入细胞
筛选含重组子的大肠杆菌
转化细菌的培养
由于质粒携带抗药基因，故获得质粒的细 菌可在抗性培养基上生长，形成单菌落。 重组子单菌落的筛选 获得质粒的细菌均可形成单菌落，故需进 一步鉴定具有外源基因插入的重组子单菌 落，常用方法是蓝白筛选（筛选原理下一 实验详细介绍）。
单酶切产生平端切口
单酶切产生粘末端
双酶切产生粘性末端
重组载体转化大肠杆菌
转化的关键是制备感受态细菌，使受体菌
处于易于吸收和容纳外源 DNA的易感状态。 常用方法是氯化钙冰浴法。 0º C条件下用低 渗CaCl2 溶液处理快速生长的细菌，使细胞 壁疏松，细菌膨胀成球形。 重组 DNA 分子易吸附于感受态细胞表面，短 暂的42º C热处理促进细胞对质粒的吸收。
外源基因与载体连接
外源DNA片段与载体的连接有多种方式，选择不同
酶切，连接方式也不同。 单酶切产生平端切口，与外源DNA片段连接，效率 很低。因Taq酶的特殊活性，PCR产物3‘-末端常有 突出的A。针对此特点，有3‘-末端突出的T载体。 单酶切产生粘末端，连接效率较高，但因载体两 端的粘末端相同，故外源DNA片段的连接没有方向 性，载体本身也容易回连。 双酶切产生粘性末端，连接效率高，且可确定插 入片段的方向。
浊为宜。
感受态细胞制备（二）
3000rpm2悬浮菌体沉淀，置 冰浴中静置30min。 3000rpm离心5min，弃上清。 1ml预冷的0.1M CaCl2悬浮菌体沉淀，置冰 浴中过夜。
转化（一）
取1.5ml离心管3支，按下表操作：
X-gal 40μl，均匀涂布，置37oC恒温箱至 液体消失。 阳性对照与阳性对照各取50μl涂布于抗性 平板。实验组以50μl、100μl分别涂布于 抗性平板。 37oC恒温箱培养过夜。 待有肉眼可见的菌落出现，将实验组培养 皿移至4oC显色，待用。