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HAT选择系统： HAT选择系统： 选择系统
人的突变细胞株：缺乏HGPRT 人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK TK酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT HAT培养基中 两者融合培养于HAT培养基中 HAT培养基： HAT培养基： 培养基 为次黄嘌呤， HGPRT的底物 的底物， DNA合成提 H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提 供原料（核苷酸旁路合成原料） 供原料（核苷酸旁路合成原料） 可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP DNA合成 TMP合成受抑 A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑 制） 在胸苷激酶（TK） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核 苷酸， DNA合成提供原料 苷酸，为DNA合成提供原料
1）概念： 概念： 基因定位的连锁分析是根据基因在染 色体上呈直线排列， 色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成 连锁群的原理， 连锁群的原理，即应用被定位的基因与同 一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的 特点进行定位。 特点进行定位。
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2）重组值（recombination fraction） fraction） 重组值（ 是基因定位时两个基因间遗传图距的量 即基因间的遗传距离。 度，即基因间的遗传距离。如果两个基因 间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。 1%的重组值 间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。 centimorgan，cM） （centimorgan，cM） 遗传标记（ marker） 3）遗传标记（genetic marker） 用连锁分析发法进行基因定位需要已知 的记忆内作为遗传标记， 的记忆内作为遗传标记，这些标记按孟德 尔方式遗传，标记位点应是多态的。 尔方式遗传，标记位点应是多态的。
第四节 基因定位常用的方法
Wilson于1911年将红绿色盲基因首次定位于 Wilson于1911年将红绿色盲基因首次定位于X 年将红绿色盲基因首次定位于X 染色体上,开创了人类基因定位的先河.1968 染色体上,开创了人类基因定位的先河.1968 ,Donahue利用系谱分析的方法将Duffy血型基因 利用系谱分析的方法将Duffy 年,Donahue利用系谱分析的方法将Duffy血型基因 定位于1 号染色体上, 定位于1 号染色体上,是人类首次在常染色体上进 行的基因定位.20世纪70年代后, .20世纪70年代后 行的基因定位.20世纪70年代后,体细胞杂交重组 DNA、分子杂交和PCR等技术的出现和应用， PCR等技术的出现和应用 DNA、分子杂交和PCR等技术的出现和应用，基因 定位的方法愈加先进，基因定位的速度、 定位的方法愈加先进，基因定位的速度、数量明 显加快。人类基因组计划的实施和完成， 显加快。人类基因组计划的实施和完成，更加促 进了基因定位的进程。 进了基因定位的进程。 基因定位对提高人类对疾病产生的病因学的 认识有重要意义。 认识有重要意义。
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3）原位杂交的特点： 原位杂交的特点： 杂交在载玻片上的中期染色体上进行， 杂交在载玻片上的中期染色体上进行， 而不是在溶液和膜上进行。 而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指 在标本上DNA原位变性， DNA原位变性 在标本上DNA原位变性，再与放射性或非放 射性物质（通常用3H 3H） 射性物质（通常用3H）标记的已知核酸探 针杂交， 针杂交，通过放射自显影来检测染色体上 特异DNA RNA顺序 DNA或 顺序， 特异DNA或RNA顺序，用放射性颗粒在某条 染色体的区带出现的最高频率或荧光的强 度来确定探针的位置， 度来确定探针的位置，从而准确地进行基 因定位。 因定位。
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2）对象： 人的细胞 对象： 鼠类：大鼠、小鼠、 鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠 3）杂种细胞的特点： 杂种细胞的特点： 在繁殖传代过程中，人的染色体优先 在繁殖传代过程中， 丢失， 丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色 而啮齿类的染色体被保留下来。 体，而啮齿类的染色体被保留下来。
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4）原理： 原理： 细胞进行融合时，培养液中只有部分细 细胞进行融合时， 胞融合成杂种细胞， 胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双 亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。 亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。 为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而 为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而 亲本细胞死亡的环境。 亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细 胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的 最常用的是HAT 差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择 差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择 系统。 系统。
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4）原位杂交的步骤
制备中期染色体 DNA原位变性 DNA原位变性 变性 放射性或非放射性标记探针 杂交（在载玻片上） 杂交（在载玻片上） 洗膜 检测 放射性标记：放射自显影 放射性标记： 非放射性标记： 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合 结合染色体形态进行基因定位
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记录杂交信号
5）荧光原位杂交
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明确几个基本概念 基 因：DNA的功能片段。 DNA的功能片段 的功能片段。 基因组：有机体全部DNA序列（ DNA序列 基因组：有机体全部DNA序列（它包括基因 外的非基因DNA序列）， DNA序列），它是基因和 外的非基因DNA序列），它是基因和 非基因DNA序列的总和。 DNA序列的总和 非基因DNA序列的总和。 基因定位： 基因定位：是用一定的方法将基因确定到染 色体的实际位置。 色体的实际位置。
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遗传做图：是以研究家族的减数分裂， 遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两 个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离， 个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离， 它表明基因之间连锁关系和相对距离， 它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组 率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。 率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。 染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。 染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。 细胞水平上的基因图又称细胞遗传图 细胞水平上的基因图又称细胞遗传图 区域定位：从细胞遗传学水平， 区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等 技术在光学显微镜下观察， 技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体 的具体区带。 的具体区带。
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因此在HAT 因此在HAT培养基上 HAT培养基上
人细胞： 人细胞： 由于A的存在，正常的DNA ①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受 阻 。 同时由于HGPRT的缺乏， HGPRT的缺乏 ②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄 嘌呤通过旁路合成DNA 嘌呤合成障碍） DNA（ 嘌呤通过旁路合成DNA（ 嘌呤合成障碍）
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将筛选出来的杂种细胞转移到正常培 养基继续培养， 养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同 的生化和免疫学特性，Miller等运用体细 的生化和免疫学特性，Miller等运用体细 胞杂交并结合杂种细胞的特征， 胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种 细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。 ）。凡是含 细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含 有人17号染色体的杂种细胞都因有TK 17号染色体的杂种细胞都因有TK活性 有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性 而存活，反之则死亡，从而推断TK TK基因定 而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定 位于17号染色体上， 17号染色体上 位于17号染色体上，这是首例应用体细胞 杂交法进行的基因定位。 杂交法进行的基因定位。
（florescence in situ hybridization，FISH） hybridization，FISH） 用 特 殊 荧 光 素 （ dig 或 Biotin ） 标 记 探 针 DNA（ 标记法） DNA（Nick translation 标记法），变性成单 链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA 杂交。 DNA杂交 链后与变性后的染色体或细胞核靶 DNA 杂交 。 在荧光显微镜下观察并记录结果。 在荧光显微镜下观察并记录结果。
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二、基因克隆
致病基因克隆有两种基本策略 功能克隆 定位克隆 功能克隆(functional 1、功能克隆(functional cloning) 是利用疾病已知的遗传损伤而引起的生化功 能如蛋白质氨基酸缺陷的信息,进行基因定位, 能如蛋白质氨基酸缺陷的信息,进行基因定位, 进而克隆该基因. 进而克隆该基因.
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一、基因定位的方法
1、体细胞杂交法基因定位： 体细胞杂交法基因定位： 体细胞： 体细胞：即生物体除生殖细胞外的任一细 胞。 体细胞杂交的概念 的概念： 1）体细胞杂交的概念： 也称细胞融合（ infusion）， ），是 也称细胞融合（cell infusion），是 将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。 将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。 新产生的细胞称杂种细胞（ cell）， 新产生的细胞称杂种细胞（hybrid cell）， 含双亲不同的染色体。 含双亲不同的染色体。
FISH
优点：可用来作基因或特定DNA DNA片段的染色体区 优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区 域定位。 域定位。 缺点：必须在已知探针的情况下方可进行。 缺点：必须在已知探针的情况下方可进行。
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单色FISH 单色FISH
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多色FISH 多色FISH
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3.连锁分析（ 3.连锁分析（Linkage analysis） analysis） 连锁分析
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鼠细胞：由于A的存在正常的DNA 鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通 DNA合成通 道受阻， HGPRT可以利用次黄嘌呤合成 道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成 腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合 腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK TK， 成胸腺嘧啶。（ 。（嘧啶合成障碍 成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍 ） 杂种细胞： HGPRT旁路合成腺嘌呤 旁路合成腺嘌呤, 杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟 嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（ TK合成胸腺嘧啶 嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌 呤和嘧啶都可以正常合成） 呤和嘧啶都可以正常合成）