【实验题目】
放线菌的形态观察
【实验目的】
1、掌握放线菌观察方法—插片法
2、了解放线菌的基本形态
【实验器材】
1、菌种：
青色链霉菌、弗氏链霉菌
2、培养基：
灭菌的高氏Ⅰ号琼脂培养基
3、仪器和用具：
显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、培养皿等
【实验原理】
1．高氏I号培养基
高氏I号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。

此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。

因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。

此外，合成培养基有的还要补加微量元素，如高氏I号培养基中，需要加入FeSO4。

2．放线菌
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。

常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝，并进一步分化产生孢子丝及孢子。

有的放线菌只产生基内菌丝而无气生菌丝。

在显微镜下直接观察时，气生菌丝在上层、基内菌丝在下层，且气生菌丝较暗，基内菌丝较透明。

孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。

在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。

能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。

图1：链霉菌一般形态和构造（模式图）
1-直形，交叉分枝
2-丛生，波曲
3-顶端形成大螺旋
4-松螺旋
5,6-紧螺旋
7-短而直，轮生
图2：链霉菌属孢子丝的主要类型
3．插片法
将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。

观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。

这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。

1-盖玻片
2-琼脂层
图3
【实验内容及步骤】
1、高氏I号培养基的制备（100ml）
1)根据配方按照一定比例称取可溶性溶粉、及其他成分溶解。

2)待将所有药品溶解后，补充水分到所需的总体积，进行pH调节到7.2～7.4
3)材料灭菌：将所配溶液装在三角烧瓶中并加棉塞，棉塞外包一层牛皮纸，并用麻绳捆好，
用记号笔标记组号。

取4个平皿，包好并标记。

同理盖玻片也用牛皮纸包好，10片一包，准备4包。

将上述物品放入密封的加压灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌121℃、20分钟。

2、插片法进行链霉菌的观察
1) 倒平板：取融化并冷至大约50℃的高氏I 号培养基分装到4个培养皿中，倒平板时尽量使培养基厚一些，凝固待用。

（可用记号笔在培养基底部画好方向）
2) 接种：待培养基冷却凝固后，无菌操作，用接种环挑取菌种在平板上密集划线接种。

（沿着之前用记号笔标注的方向进行划线接种）
3) 插片：以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约与培养基成45°角插入平板内，并与划线垂直（即与记号笔标注的方向垂直），每个平板至少插入3个盖玻片。

4) 培养：将平板倒置，28℃下培养7天。

5) 镜检：用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，将无菌面朝上放在载玻片上，直接镜检。

观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察，必要时可用油镜观察。

【实验结果】
一、链霉菌形态观察记录表 菌种 基内菌丝 气生菌丝 孢子丝 青色链霉菌 菌丝较长，较疏松，
多分枝 毛状 螺旋状，末端有 弗氏链霉菌
菌丝直或折曲，较密，
多分枝
厚絮状
直链状，末端有圆形
孢子
二、镜检结果
图4：弗氏链霉菌（10*40） 图5：弗氏链霉菌局部放大图 图6：弗氏链霉菌孢子丝
基内菌丝（明）
气生菌丝（暗）
图7：青色链霉菌（10*40） 图8：青色链霉菌局部放大图 图9：青色链霉菌孢子丝
【实验小结】
1、链霉菌的菌落特征：经过镜检，可观察到放线菌菌丝呈分枝丝状，且多交错在一起，由基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三部分组成，基内菌丝透明，有较多的分枝，而气生菌丝较暗。

两种菌丝在不同的焦平面上，可通过调节细准焦螺旋分别进行观察。

放线菌有与细菌不同的菌落特征：干燥、不透明，表面呈紧密的丝绒状，菌落和培养基的连接紧密，难以挑取菌落。

2、为何采用插片观察法：放线菌菌落小，与培养基结合较紧密，不易用接种钩挑取，因而难以直接观察。

而采用插片法，在接种放线菌的培养基一侧，以45°角插入无菌盖玻片，使放线菌沿培养基与盖玻片交界处生长，并附着于盖玻片上，待菌丝生长一段时间后，可直接取下盖玻片进行染色观察。

该方法可以进行放线菌营养菌丝、气生菌丝和孢子丝的比较观察。

3、为何采用高氏一号培养基：这是一种半合成培养基，采用可溶性淀粉为碳源、KNO3为氮源。

因为缺乏速效的碳源和氮源，该培养基的营养较为匮乏，有利于放线菌产生孢子。

同时，由于链霉菌生长较慢，因此用来培养链霉菌的培养基平板要比培养细菌的要厚一些。

4、实验操作时应注意哪些：
①倒平板要稍厚一些，接种时划线要密，最好用记号笔标好划线方向，插片时与划线方向相垂直，这样可防止插到划线的空隙上，较容易使菌丝长在盖玻片上。

②镜检时，宜用略暗光线，先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。

③低倍镜观察时，菌面应该朝上，不然菌体会被压扁，不好观察。

换用油镜观察，要把菌面朝下，否则滴加香柏油后，菌体会滑动影响观察且会污染镜头。

【思考与讨论】
1.镜检时如何区分放线菌基内菌丝、气生菌丝及孢子丝？
基内菌丝（明）
气
生菌丝（暗）
答：在光学显微镜下观察，气生菌丝在上层、较明亮，基内菌丝在下层、颜色较暗，气生菌丝较基内菌丝粗。

有些气生菌丝发育到一定阶段在菌丝末端分化形成孢子丝。

【附录】培养基配方
高氏I号培养基（培养放线菌用）。