蛋 白 质 纯 化 仪 使 用 说 明
1.认识机器
本机器常规流程图：
使用机器前所有端口请按如图所示连接，将“A 泵溶液进口线”“B 泵溶液进口线”放进超纯水中。
按如图所示先不要连接柱子。
建议一般使用A 泵进液，如需梯度洗脱时才用B 泵。
***除上样样品（14000 rpm/12000 rpm 离心30min ）外，所有在此机器上要用的溶液必须要经过0.22 μm 滤膜过滤。
***
样品泵
A 泵
B 泵 多波长检测器 pH 计 混合池 层析柱 切换阀
进样环 溶液由A/B 泵进入仪器 进样阀
层析柱切换阀
多波长检测处 自动收集器 废 液 出 口
A 泵溶液进口线
B 泵溶液进口线 整合电导检测
2.开机
打开计算机、蛋白质纯化仪（电源在右侧下角）、自动收集器（电源在后面右侧）。
此时蛋白质纯化仪上部分指示灯会亮，有黄色的、有蓝色的，开机较慢，请稍等，当蛋白质纯化仪上所有指示灯不亮时，才可进行操作。
3.启动电脑“ChromLab”软件
双击电脑“ChromLab”应用程序，进入如下界面：
4.洗泵
单击“Manual Run”进入：
我们主要看右下方这块（图中所示模块均可双击设置参数）：
双击“样品泵”模块出现如图所示对话框：
双击“层析柱切换阀”模块如下图所示：
此步骤主要是洗泵工作，请确保层析柱不在程序中，点击“Bypass ” 点击此处可让可更
改溶液的流动方向。
点击1-5可设置连接
不同的层析柱端口 设置流速 设置压力，小于选择的柱子承受最大压力。
在下面“控制流速以防止超压”前面打对勾，以保护柱子。
不特殊设置，默认A 泵工作
此处可控制机器的运行与停止。
双击“样品泵”模块出现如下图所示：
选择“System Pump Waste”模式后，轻按仪器上“A泵”的“Purge”按钮，稍等片刻，即将进行A泵的洗泵工作，此时流速将会达到最大10 mL/min。
如果想洗B泵（凝胶过滤时不需要），轻按仪器上“B 泵”的“Purge”按钮即可。
注意此时废液将从“样品泵”模块上的“Waste 2”出口处留出，拿好废液缸。
目的：洗A、B泵目的：Loop环上样
A、B泵洗完后，选择“Manual Load Loop”点击“Start”让超纯水在机身内流动片刻，此时废液将从自动收集器那边的废液口流出。
点击“Stop”再选择“System Pump Inject Loop”此时再开始，将冲洗样品环。
最后停止。
将A、B泵溶液进口线分别放入后续实验需要用的缓冲液中，重复以上过程。
嗯，洗完泵以后，把A泵溶液进口线放入超纯水中。
5.Developing a Method
单击“New Method ”进入如下界面：
首先，我们先选择合适模块运行程序，如1中的流程图所示是最佳选择：
如图所示是Ni-Affinity 1mL 柱体积的最佳模式：
选择运行模块按钮 选择柱子类型 选择柱子型号 柱子体积
柱子所承受最大压力 选择柱子连接端口处 自动收集器板块，目前实验室只能选择这个 控制程序默认流速处，一定要勾选第一个，防止操作不当导致压力过大，对柱子造成损伤。
第二个不必选中，本机器没有购买空气检测器。
此处勾选，pH 计才正常工作 设置
波
长
检
测处 可设置按柱体积（CV ）走溶液的用量，还是按ml 数走溶液用量 260
如图所示是Gel-filtration ENrichTM SEC 650的最佳模式：
当创建好上述内容后，我们就开始设置具体的步骤，一般来说一个纯化过程以下步骤是不可少的，如图：（此时可以点击左侧需要步骤按住不放，拖到右侧即可创建，添加洗脱步骤时一般选择“Colum Wash”创建）
柱平衡
进样
洗柱
洗脱样品
把鼠标放在右侧过程图中，单击右键可修改步骤名称。
下图流程仅供参考。
Ni-Affinity 模式 Gel-filtration 模式：
可根据情况适当调整
下一步就是设置每一步的流速和溶液用量了（点击你所要设置的步骤，在右侧就会出现相应的设置条件）：
例如，水洗、挂Ni 2+、柱平衡、不同浓度咪唑洗脱、EDTA 洗脱、20% 乙醇冲柱等过程设置如图：
20 % ethanol 水洗
20 % 乙醇
此处设置流速，打钩为默认流速，可不勾选，设置自需流速 单一溶液洗脱时，双击此按钮，当B 溶液为
100%时，说明溶液全部从B 泵进入。
为0时，溶液均从A 泵进。
当设置梯度洗脱时双击此按钮。
连续梯度洗脱，不设B 溶液的百分比，只设置洗脱溶液体积即可；阶段性梯度洗脱，需设置B 溶液的百分比和洗脱体积。
例图所示代表含义为：50%的A 溶液和50%的B 溶液混合后洗脱，洗脱体积为10个柱体。
勾选此处可设置，自动收集。
全部收集 设置收集体积， 图例为0.2 mL 每管 单击此处，可设置按波峰收集。
一般不建议用。
除非已对所纯化蛋白出峰位置非常了解。
样品进样设置如下：
按如上过程设置好自己需要的流程后，即可开始程序：
点击上方第二行的“Star Run ”→“OK ”即可。
运行以后会出现如下图画面，等待机器运行：
设置进样环体积1ml/5ml 首先单击这里 选择进样环进样 设置流速，建议不要太快，影响挂柱效率 设置进样环体积1ml/5ml
程序运行以后，先不要急着休息，点击下图左上角的“Hold Step”，此时连接柱子。
将“层析柱交换阀”上相互连接的两根线从中间拧开，接柱子。
注意：
1.注意柱身上标示的溶液流动方向（上端→下端）。
2.旋开柱子顶端和下端的螺母，让纯化仪的出水端先连接柱子的下端，让水从柱子的上端流出，待柱子上端有水滴停留时，将纯化仪的出水端接到柱子的上端，此时再连接柱子的下端。
目的：防止有气泡进入柱子内。
3.如果用凝胶过滤柱时，除了要特别注意防止气泡进入，还要，注意的摆放姿势一定要保持垂直，否则会影响纯化的效率。
4.顺便说一下，柱子使用完毕后，应在保持液体流动的情况下，先拆卸柱子的下端，再拆卸柱子的上端，防止柱内保护液体的损失。
4℃保存。
柱子安装完毕后，在“Hold Step”点击“Resume”开始运行你预先设置好的程序。
嗯，当然，咱们的机器也不是全自动的，开头和结尾还是需要动身换一下相应的溶液的。
1.记好是A泵还是B泵进液。
2.换溶液时，
注意将仪器暂停以后再操作，手不要抖，动作尽可能的慢一点。
3.换溶液时，还要注意看看溶液进口处有没有空气进入，有的话，可以用注射器加点液体到细管内。
好了，那就可以安心的让它运行了。
*记得柱平衡步骤时，调零。
此时如果无聊的话，你就可以将样品倒吸入样品环了，反正早晚也要弄。
顺便把注射器、进样针、Loop环和自制的出液口细管（连接在样品泵“Waste 2”的出口上）再用缓冲液多洗两遍以防止污染。
*注意你的样品要提前在14000 rpm（最好，还可冷冻离心）/12000 rpm离心30 min，重新将上清转移到新的离心管中，以确保样品中不含微小颗粒，防止阻塞仪器和柱子。
*上样技巧：
1.确定你的样品量：以1 mL进样环为例，最好样品体积为800-900 μl最佳，此时倒吸一定不要人为引入气泡。
2.然后用200-100 μl的蛋白缓冲涮洗离心管。
1 mL你懂得，千万不能超。
3.加样后，进样针就不可以离开进样孔了，否则样品将会从被吸上来的地方流出去。
冲洗离心管时让它留在那就行了。
4.倒吸涮洗离心管的溶液时，可将溶液都吸完，还可以稍微多吸那么一点点，但也仅仅那么一点点，为了是不让样品浪费，你要保证空气不能进入进样环哦~
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