底物浓度对酶促反应速度的影响
——米氏常数的测定
一．目的要求
1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。

1.2掌握测定米氏常数K m 的原理和方法。

二．实验原理
酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：
式中：
v ——反应初速度（微摩尔浓度变化/min ）；
V ——最大反应速度（微摩尔浓度变化/min ）； [s]——底物浓度（mol/L ）； K m ——米氏常数（mol/L ）。

这个方程表明当已知K m 及V 时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。

K m 值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。

不同的酶，K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似地反应酶与底物的亲和力大小：K m 值越大，表明亲和力小；K m 值小，表明亲和力大。

则测K m 值是酶学研究的一个重要方法。

大多数纯酶的K m 值在0.01～100mmol/L 。

Linewaeaver-Burk 作图法（双倒数作图法）是用实验方法测K m 值的最常用的简便方法：
实验时可选择不同的[s]，测定对应的v ，以 对 作图，得到一个斜率为V K
m
的直线，其截距
][1s 则为m
K 1，由此可求出K m 的值（截距的负倒数）。

本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Linewaeaver-Burk 双倒数作图法测定双倒数作图法。

胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。

水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。

]
[][s K s V v m +=
V s V K v m 1
][1.1+
=v 1][1s
三．试剂和器材
3.1 试剂
A.10～30g/L的酪蛋白溶液（pH8.5）：
分别取10、20、25、30g酪蛋白溶于约900mL水中，加20mL 1mol/L NaOH 连续振荡，微热直至溶解，以1mol/L HCl 或1mol/L NaOH调pH至8.5，定容1L，即生成四种不同[s]的酪蛋白标准溶液。

B.中性甲醛溶液：
100mL分析甲醛加20 mL 0.25％酚酞乙醇溶液，以0.1mol/L NaOH滴至微红，密闭于玻璃瓶中。

C.0.25%酚酞乙醇溶液：
2.5g酚酞以50%乙醇溶解，并定容至1L。

D.标准0.1mol/L NaOH溶液：
事先用邻苯二甲酸氢钾标定过。

3.2 材料
胰酶溶液：称取3g胰酶（胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的混合物）溶于25ml蒸馏水中，放入冰箱保存。

3.3 器材
恒温水浴；50ml三角烧瓶（×16），150ml三角烧瓶（×4）；吸管5ml（×1），10ml（×5）；量筒100ml（×4）；25ml碱式滴定管及滴定台，蝴蝶夹；恒温水浴；滴管。

四．操作方法
1. 取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚酞，以0.1mol/L标准NaOH滴定至微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。

2. 量取30g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三角瓶，37℃保温10min，然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中。

（同时计时！）充分混合后立即取出10mL反应液（定为0号样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1号）加10滴酚酞。

以0.1mol/L NaOH 毫升数，记下耗去的0.1mol/L标准NaOH的毫升数。

3. 在2min，4min，6min时，分别取出10mL反应液，加入2号，3号，4号小三角瓶，同上操作，记下耗去NaOH的毫升数。

以滴定度（即NaOH的毫升数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度为V40（相对于40g/L的酪蛋白浓度）。

然后分别量取25g/L，20g/L，10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V25、V20、V10。

利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与Km值。

五．实验数据处理
5.1.实验原始数据记录：如表1中所示。

表1 实验数据记录
实验号（酶解时间/min）酪蛋白浓度1（0）2（2）3（4）4（6）
NaOH消耗的体积/ml
10g/L 0.88 1.32 1.52 1.74
20g/L 1.19 1.67 2.07 2.35
25g/L 1.51 1.87 2.29 2.80
30g/L 1.51 1.98 2.53 2.99
5.2相对各浓度酪蛋白的各初速度值
以滴定度（即NaOH的毫升数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度值。

（1）相对于10g/L酪蛋白的初速度V10
根据数据作图得图1-1。

由图1-1中得直线方程y=0.139x+0.948，其斜率为0.139，即为V10=0.139g/L·min。

（2）相对于20g/L酪蛋白的初速度V20
根据数据作图得图2。

由图2中得直线方程y=0.194x+1.238，其斜率为0.194，即为V20=0.194g/L·min。

（3）相对于25g/L酪蛋白的初速度V25
根据数据作图得图1-3。

由图1-3中得直线方程y=0.215x+1.474，其斜率为0.215，即为V25=0.215 g/L·min。

（4）相对于30g/L酪蛋白的初速度V30
根据数据作图得图1-4。

由图1-4中得直线方程y=0.250+1.504，其斜率为0.250，即为V30= 0.250g/L·min。

5.3求解V与Km值
表2 求得的v与[s]值
酪蛋白浓度[s]/(g/L)1/[s] 初速度v /(g / L·min) 1/v
10 0.100 0.1397.194
20 0.050 0.194 5.155
25 0.040 0.215 4.651
30 0.033 0.250 4.000
以1/v对1/[s]作图，得一直线（见图2），其斜率即Km/V，截距即1/V，即求出V与Km值。

由图2可知，斜率为45.14，截距为2.7334，即Km /V= 45.14 ，1/V=2.7334
所以，Km=45.14/2.7334=16.51g/L
六．实验结果与讨论
实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。

原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制并加速逆反应的进行，酶在一定PH及温度下部分失活等。

因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。

在本实验中，图1-1和1-2线性不是很理想，可能的原因有：
（1）酶促反应的时间没有得到严格的控制
（2）实验所用的酶是粗酶液，是胰酶溶液是胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物，并不是纯酶。

我们知道酶的催化具有高度的专一性，一种酶只能作用于特定的底物，所以本实验中所用的酶不能准确反应酶作用于底物的反应速度。

七．思考题
1.试述底物浓度对酶促反应速度的影响。

(1) 在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，反应相对于底物是一级反应。

(2) 在较高的底物浓度下，酶被饱和，进一步提高底物浓度，反应速度提高，但并不是成比例增加，反应相对于底物是混合级反应。

(3) 当所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使再增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不增加，反应相对于底物是个零级反应。

在实际测定中，即使酶浓度足够高，随底物浓度的升高，酶促反应速度并没有因此增加，甚至受到抑制。

其原因是：高浓度底物降低了水的有效浓度，降低了分子扩散性，从而降低了酶促反应速度。

过量的底物聚集在酶分子上，生成无活性的中间产物，不能释放出酶分子，从而也会降低反应速度。

2.在什么条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？
当酶作用的底物是酶的最适底物时，并且在最适的pH最适温度以及离子强度等条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段。

因为同一种酶的不同底物作用，不同pH、温度以及离子强度等条件下测定的Km值是不同的。

3.米式方程中的Km值有何实际应用？
(1) 鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。

(2) 判断酶的最适底物：一种酶如果可以作用于几个底物，就有几个Km值。

测定各种底物的Km值，Km最小的就是最适底物。

(3) 计算一定速度下的底物浓度：由Km值及米氏方程可决定在所要求的反应速度下应加入的底物浓度。

(4) 了解酶的底物在体内具有的浓度水平
(5) 判断反应方向或趋势：催化可逆反应的酶，对正逆两向的Km值通常是不同的。

(6) 推测代谢途径
(7) 判断抑制类型：测定不同抑制剂对某个酶的Km值及Vmax的影响，可以判断该抑制剂的抑制作用类型。